本文選題：鼻咽癌　切入點：雙特異性抗獨特型抗體　出處：《中南大學》2011年博士論文

【摘要】：第一章鼻咽癌人源雙特異性抗獨特型抗體疫苗的制備及活性鑒定 目的：構建能夠表達全人源鼻咽癌雙特異性抗獨特型抗體的原核表達載體pET25b-G22-I50及單價抗獨特型抗體的原核表達載體pET25b-G22、pET25b-I50,并對其表達產物作初步鑒定。 方法：利用分子克隆技術依次或分別將G22、I50插入到原核表達載體pET25b(+)中,轉化入E.coli DH5a,經菌落PCR、雙酶切驗證并測序。將陽性重組子轉化入表達菌株E.coli BL21(DE3),經IPTG誘導表達后,表達的重組蛋白經His-tag純化試劑盒純化后復性。用Western blot方法鑒定抗獨特型抗體G22-I50、G22、I50的表達,ELISA方法分析其蛋白活性。 結果：構建的原核表達載體pET25b-G22-I50、pET25b-G22、pET25b-I50經測序驗證,序列正確。三種蛋白G22-I50、G22、150均以包涵體形式高效表達,經純化后純度達90%以上。Western blot鑒定表達的蛋白相對分子質量(Mr)分別約42 000,27 000,15 000,與預期相符。ELISA方法鑒定復性后的蛋白均已恢復活性,能夠用于體外實驗。 結論：成功獲得了有活性的人源雙特異性抗獨特型抗體G22-I50及單價的抗獨特型抗體G22、I50,為研究鼻咽癌抗獨特型抗體疫苗的主動免疫機制鑒定了堅實的基礎。 第二章雙特異性抗獨特型抗體體外抗腫瘤免疫機制研究 目的：比較鼻咽癌雙價雙特異性抗獨特型抗體G22-I50與單價的抗獨特型抗體G22、I50在體外抗腫瘤免疫情況,并對其可能的機制作初步探討。 方法：誘導表達G22-I50、G22、I50三種蛋白并用Western blot及ELISA方法進行活性鑒定。常規(guī)分離人外周血單個核細胞(PBMC),分別用G22-I5C、G22、150抗獨特型抗體刺激并培養(yǎng),采用MTT法、LDH釋放法分別觀察淋巴細胞增殖情況和細胞毒作用,ELISA方法測定用各抗獨特型抗體刺激后培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平的變化,流式細胞術檢測刺激后淋巴細胞表型的改變。 結果：與G22、I50組相比,G22-I50刺激后的PBMC增殖明顯,且對鼻咽癌細胞HNE2有特異的殺傷作用。G22-I50刺激后的PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-y、IL-2水平均比G22、I50組有所增加,而對IL-4水平沒有明顯影響。流式細胞術顯示刺激后的PBMC中CD4+CD8+T細胞比例增加,CD4/CD8的比率增加,而CD4+CD25+Treg細胞的比例有所減少,其中以G22-I50組最為明顯。 結論：G22-I50具有更強的免疫原性并能增強PBMC的特異性殺瘤作用,其機制可能與促進PBMC的增殖,誘導具有抗腫瘤作用的Thl細胞因子的分泌并活化CD8+T細胞,抑制CD4+CD25+Treg細胞的表達有關。 第三章雙特異性抗獨特型抗體體內抗腫瘤免疫機制研究 目的：分別利用Balb/c小鼠和hu-PBL-SCID小鼠模型研究雙特異性抗體疫苗的抗腫瘤效應,并對其可能的機制作深入探討。 方法：將雙特異性抗獨特型抗體疫苗G22-I50及單價的抗獨特型抗體疫苗G22、I50分別免疫Balb/c小鼠,通過間接ELISA、競爭抑制ELISA法檢測各蛋白疫苗免疫后誘導的體液免疫反應情況；通過淋巴細胞增殖實驗檢測免疫后小鼠的細胞免疫反應情況；通過檢測Th1、Th2型細胞因子的表達情況,以判斷各蛋白疫苗免疫后的免疫反應類型。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系統(tǒng)并進行鑒定,分別將上述幾種抗獨特型抗體疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠,并接種鼻咽癌細胞HNE2,或先接種HNE2細胞后再用各種疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠,評價疫苗的抗腫瘤免疫保護與免疫治療作用。定期檢測腫瘤體積、記錄腫瘤形成的潛伏期,生存時間,并對腫瘤組織作病理學檢查。同時,用雙抗夾心ELISA法檢測脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的分泌情況,用LDH法檢測脾淋巴細胞的殺傷活性,以FCM法、免疫組織化學法檢測腫瘤組織周圍浸潤的淋巴細胞情況。 結果：分別用G22-I50、G22、I50免疫Balb/c小鼠后,通過間接ELISA和競爭抑制ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),G22-I50免疫后小鼠能夠產生較高水平的Ab3抗體,且具有較強的競爭結合HNE2細胞相關抗原的能力；G22-I50免疫后小鼠的脾淋巴細胞具有較強的增殖能力,并能表達高水平的IFN-γ、IL-2。成功的重建了SCID小鼠的免疫系統(tǒng),并通過免疫保護實驗、免疫治療實驗對其抗腫瘤效應進行了評估,發(fā)現(xiàn)G22-I50能夠延長腫瘤形成的潛伏期,生存時間,能夠抵抗腫瘤的生長,并通過病理學檢查得以證實。通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)G22-I50組的脾淋巴細胞分泌的細胞因子最多,且以Th1型細胞因子為主,脾淋巴細胞的特異性殺傷能力也有明顯增強,以FCM法、免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)G22-I50組腫瘤周圍浸潤的CD4+CD25+Treg細胞顯著減少,CD3+T細胞顯著增加。 結論：G22-I50能夠同時激活機體的體液免疫反應和細胞免疫反應,并能誘導Thl細胞因子的分泌,促進CD3+T細胞的浸潤,抑制CD4+CD25+Treg細胞的浸潤,從而發(fā)揮其抗腫瘤效應。 第四章含人GM-CSF的雙特異性抗獨特型抗體融合蛋白疫苗免疫應答及免疫保護機制研究 目的：構建并表達含人GM-CSF的雙特異性抗獨特型抗體疫苗GM-CSF-G22-I50,觀察人GM-CSF和G22-I50的協(xié)同抗腫瘤作用,并對其機制作探討。 方法：常規(guī)分離人PBMC并抽提其RNA, PCR擴增GM-CSF基因,分別插入空載體pET25b(+)和已構建的重組質粒pET25b-G22-I50的上游多克隆位點,構建重組質粒pET25b-GM-CSF, pET25b-GM-CSF-G22-I50,以酶切和測序法進行鑒定。通過誘導表達、純化、復性等一系列過程獲得有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白,并用Western blot、ELISA方法來驗證蛋白的活性。將不同的蛋白疫苗GM-CSF、G22-I50、GM-CSF-G22-I50分別于背部皮下接種Balb/c小鼠,PBS免疫作為陰性對照,分別通過間接ELISA、競爭抑制ELISA法,淋巴細胞增殖實驗、細胞毒性實驗檢測免疫小鼠的體液免疫和細胞免疫反應情況,并通過雙抗夾心ELISA法檢測免疫小鼠的細胞因子分泌情況。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系統(tǒng),分別將上述幾種抗獨特型抗體疫苗免疫hu-PBL-SCID小鼠,并接種鼻咽癌細胞HNE2,定期檢測腫瘤體積、記錄腫瘤形成的潛伏期,生存時間；以RT-PCR法檢測了腫瘤組織中轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的表達情況,并檢測了腫瘤組織中ITAC及脾細胞中CXCR3的表達,以雙抗夾心ELISA法檢測了小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γIL-4、IL-10、IL-17和TGF-β的水平,以評價各疫苗的抗腫瘤效應。 結果：成功的構建了原核表達載體pET25b-GM-CSF, pET25b-GM-CSF-G22-I50,并獲得了有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白。將各種蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠后,通過間接ELISA、競爭抑制ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組小鼠體內能夠產生較強的Ab3抗體,且該抗體可以與Ab1(FC2 mAb)競爭結合HNE2細胞相關抗原；淋巴細胞增殖實驗顯示,各組免疫小鼠的脾臟淋巴細胞在體外經1μg/mL蛋白刺激后,淋巴細胞增殖能力最強,且以GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組為著,分泌的細胞因子主要以Thl型細胞因子為主；細胞毒性實驗結果發(fā)現(xiàn),與G22-I50、GM-CSF、PBS組相比,GM-CSF-G22-I50組小鼠脾淋巴細胞對HNE2細胞的特異性殺傷作用明顯增強。利用hu-PBL-SCID小鼠模型,觀察各疫苗的抗腫瘤免疫保護作用,結果發(fā)現(xiàn),與G22-I50、GM-CSF、PBS組相比,GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組小鼠的腫瘤形成潛伏期明顯延長,腫瘤體積減小,生存時間延長；RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn),GM-CSF-G22-I50組小鼠腫瘤組織周圍T-bet、GATA-3、RORyt、ITAC及脾細胞CXCR3的表達明顯增加,且脾細胞培養(yǎng)上清中分泌的細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17明顯增多,而IL-10、TGF-P明顯減少。 結論：含人GM-CSF的雙特異性抗獨特型抗體融合蛋白疫苗能夠顯著增強體液免疫、細胞免疫反應能力,從而發(fā)揮其抗腫瘤免疫保護作用,這可能與腫瘤周圍浸潤的正向調節(jié)T細胞增多,抑制性T細胞減少有著密切的關系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 趙棟;OK-432腫瘤細胞疫苗抗腫瘤效應的研究[D];山西醫(yī)科大學;2013年

，

本文編號：1718944