本文選題：鼻咽癌　切入點：雙特異性抗獨特型抗體　出處：《中南大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：第一章鼻咽癌人源雙特異性抗獨特型抗體疫苗的制備及活性鑒定 目的：構(gòu)建能夠表達(dá)全人源鼻咽癌雙特異性抗獨特型抗體的原核表達(dá)載體pET25b-G22-I50及單價抗獨特型抗體的原核表達(dá)載體pET25b-G22、pET25b-I50,并對其表達(dá)產(chǎn)物作初步鑒定。 方法：利用分子克隆技術(shù)依次或分別將G22、I50插入到原核表達(dá)載體pET25b(+)中,轉(zhuǎn)化入E.coli DH5a,經(jīng)菌落PCR、雙酶切驗證并測序。將陽性重組子轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,表達(dá)的重組蛋白經(jīng)His-tag純化試劑盒純化后復(fù)性。用Western blot方法鑒定抗獨特型抗體G22-I50、G22、I50的表達(dá),ELISA方法分析其蛋白活性。 結(jié)果：構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET25b-G22-I50、pET25b-G22、pET25b-I50經(jīng)測序驗證,序列正確。三種蛋白G22-I50、G22、150均以包涵體形式高效表達(dá),經(jīng)純化后純度達(dá)90%以上。Western blot鑒定表達(dá)的蛋白相對分子質(zhì)量(Mr)分別約42 000,27 000,15 000,與預(yù)期相符。ELISA方法鑒定復(fù)性后的蛋白均已恢復(fù)活性,能夠用于體外實驗。 結(jié)論：成功獲得了有活性的人源雙特異性抗獨特型抗體G22-I50及單價的抗獨特型抗體G22、I50,為研究鼻咽癌抗獨特型抗體疫苗的主動免疫機(jī)制鑒定了堅實的基礎(chǔ)。 第二章雙特異性抗獨特型抗體體外抗腫瘤免疫機(jī)制研究 目的：比較鼻咽癌雙價雙特異性抗獨特型抗體G22-I50與單價的抗獨特型抗體G22、I50在體外抗腫瘤免疫情況,并對其可能的機(jī)制作初步探討。 方法：誘導(dǎo)表達(dá)G22-I50、G22、I50三種蛋白并用Western blot及ELISA方法進(jìn)行活性鑒定。常規(guī)分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMC),分別用G22-I5C、G22、150抗獨特型抗體刺激并培養(yǎng),采用MTT法、LDH釋放法分別觀察淋巴細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞毒作用,ELISA方法測定用各抗獨特型抗體刺激后培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激后淋巴細(xì)胞表型的改變。 結(jié)果：與G22、I50組相比,G22-I50刺激后的PBMC增殖明顯,且對鼻咽癌細(xì)胞HNE2有特異的殺傷作用。G22-I50刺激后的PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-y、IL-2水平均比G22、I50組有所增加,而對IL-4水平?jīng)]有明顯影響。流式細(xì)胞術(shù)顯示刺激后的PBMC中CD4+CD8+T細(xì)胞比例增加,CD4/CD8的比率增加,而CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例有所減少,其中以G22-I50組最為明顯。 結(jié)論：G22-I50具有更強(qiáng)的免疫原性并能增強(qiáng)PBMC的特異性殺瘤作用,其機(jī)制可能與促進(jìn)PBMC的增殖,誘導(dǎo)具有抗腫瘤作用的Thl細(xì)胞因子的分泌并活化CD8+T細(xì)胞,抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。 第三章雙特異性抗獨特型抗體體內(nèi)抗腫瘤免疫機(jī)制研究 目的：分別利用Balb/c小鼠和hu-PBL-SCID小鼠模型研究雙特異性抗體疫苗的抗腫瘤效應(yīng),并對其可能的機(jī)制作深入探討。 方法：將雙特異性抗獨特型抗體疫苗G22-I50及單價的抗獨特型抗體疫苗G22、I50分別免疫Balb/c小鼠,通過間接ELISA、競爭抑制ELISA法檢測各蛋白疫苗免疫后誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)情況；通過淋巴細(xì)胞增殖實驗檢測免疫后小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)情況；通過檢測Th1、Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)情況,以判斷各蛋白疫苗免疫后的免疫反應(yīng)類型。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系統(tǒng)并進(jìn)行鑒定,分別將上述幾種抗獨特型抗體疫苗免疫h(yuǎn)u-PBL-SCID小鼠,并接種鼻咽癌細(xì)胞HNE2,或先接種HNE2細(xì)胞后再用各種疫苗免疫h(yuǎn)u-PBL-SCID小鼠,評價疫苗的抗腫瘤免疫保護(hù)與免疫治療作用。定期檢測腫瘤體積、記錄腫瘤形成的潛伏期,生存時間,并對腫瘤組織作病理學(xué)檢查。同時,用雙抗夾心ELISA法檢測脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌情況,用LDH法檢測脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性,以FCM法、免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織周圍浸潤的淋巴細(xì)胞情況。 結(jié)果：分別用G22-I50、G22、I50免疫Balb/c小鼠后,通過間接ELISA和競爭抑制ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),G22-I50免疫后小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的Ab3抗體,且具有較強(qiáng)的競爭結(jié)合HNE2細(xì)胞相關(guān)抗原的能力；G22-I50免疫后小鼠的脾淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力,并能表達(dá)高水平的IFN-γ、IL-2。成功的重建了SCID小鼠的免疫系統(tǒng),并通過免疫保護(hù)實驗、免疫治療實驗對其抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行了評估,發(fā)現(xiàn)G22-I50能夠延長腫瘤形成的潛伏期,生存時間,能夠抵抗腫瘤的生長,并通過病理學(xué)檢查得以證實。通過ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)G22-I50組的脾淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子最多,且以Th1型細(xì)胞因子為主,脾淋巴細(xì)胞的特異性殺傷能力也有明顯增強(qiáng),以FCM法、免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)G22-I50組腫瘤周圍浸潤的CD4+CD25+Treg細(xì)胞顯著減少,CD3+T細(xì)胞顯著增加。 結(jié)論：G22-I50能夠同時激活機(jī)體的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng),并能誘導(dǎo)Thl細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)CD3+T細(xì)胞的浸潤,抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞的浸潤,從而發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。 第四章含人GM-CSF的雙特異性抗獨特型抗體融合蛋白疫苗免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)機(jī)制研究 目的：構(gòu)建并表達(dá)含人GM-CSF的雙特異性抗獨特型抗體疫苗GM-CSF-G22-I50,觀察人GM-CSF和G22-I50的協(xié)同抗腫瘤作用,并對其機(jī)制作探討。 方法：常規(guī)分離人PBMC并抽提其RNA, PCR擴(kuò)增GM-CSF基因,分別插入空載體pET25b(+)和已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET25b-G22-I50的上游多克隆位點,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET25b-GM-CSF, pET25b-GM-CSF-G22-I50,以酶切和測序法進(jìn)行鑒定。通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化、復(fù)性等一系列過程獲得有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白,并用Western blot、ELISA方法來驗證蛋白的活性。將不同的蛋白疫苗GM-CSF、G22-I50、GM-CSF-G22-I50分別于背部皮下接種Balb/c小鼠,PBS免疫作為陰性對照,分別通過間接ELISA、競爭抑制ELISA法,淋巴細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞毒性實驗檢測免疫小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)情況,并通過雙抗夾心ELISA法檢測免疫小鼠的細(xì)胞因子分泌情況。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系統(tǒng),分別將上述幾種抗獨特型抗體疫苗免疫h(yuǎn)u-PBL-SCID小鼠,并接種鼻咽癌細(xì)胞HNE2,定期檢測腫瘤體積、記錄腫瘤形成的潛伏期,生存時間；以RT-PCR法檢測了腫瘤組織中轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的表達(dá)情況,并檢測了腫瘤組織中ITAC及脾細(xì)胞中CXCR3的表達(dá),以雙抗夾心ELISA法檢測了小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γIL-4、IL-10、IL-17和TGF-β的水平,以評價各疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。 結(jié)果：成功的構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET25b-GM-CSF, pET25b-GM-CSF-G22-I50,并獲得了有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白。將各種蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠后,通過間接ELISA、競爭抑制ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的Ab3抗體,且該抗體可以與Ab1(FC2 mAb)競爭結(jié)合HNE2細(xì)胞相關(guān)抗原；淋巴細(xì)胞增殖實驗顯示,各組免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)1μg/mL蛋白刺激后,淋巴細(xì)胞增殖能力最強(qiáng),且以GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組為著,分泌的細(xì)胞因子主要以Thl型細(xì)胞因子為主；細(xì)胞毒性實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與G22-I50、GM-CSF、PBS組相比,GM-CSF-G22-I50組小鼠脾淋巴細(xì)胞對HNE2細(xì)胞的特異性殺傷作用明顯增強(qiáng)。利用hu-PBL-SCID小鼠模型,觀察各疫苗的抗腫瘤免疫保護(hù)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與G22-I50、GM-CSF、PBS組相比,GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組小鼠的腫瘤形成潛伏期明顯延長,腫瘤體積減小,生存時間延長；RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn),GM-CSF-G22-I50組小鼠腫瘤組織周圍T-bet、GATA-3、RORyt、ITAC及脾細(xì)胞CXCR3的表達(dá)明顯增加,且脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17明顯增多,而IL-10、TGF-P明顯減少。 結(jié)論：含人GM-CSF的雙特異性抗獨特型抗體融合蛋白疫苗能夠顯著增強(qiáng)體液免疫、細(xì)胞免疫反應(yīng)能力,從而發(fā)揮其抗腫瘤免疫保護(hù)作用,這可能與腫瘤周圍浸潤的正向調(diào)節(jié)T細(xì)胞增多,抑制性T細(xì)胞減少有著密切的關(guān)系。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 趙棟;OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗抗腫瘤效應(yīng)的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2013年

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本文編號：1718944