本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：臍帶　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem cells, MSCs)具有干細(xì)胞的基本特征,即長期的自我更新、向多種組織或細(xì)胞分化的能力,是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一。MSCs存在于體內(nèi)多種組織,包括骨髓、脂肪組織和外周血。MSCs相對于傳統(tǒng)的神經(jīng)干、胚胎干細(xì)胞及造血干細(xì)胞等有很多優(yōu)點(diǎn),如易于獲得、更易培養(yǎng)和擴(kuò)增、自體移植而少有排斥、體外培養(yǎng)較少產(chǎn)生基因變異。目前,骨髓是MSCs的重要來源。但隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其來源相對貧乏。本實(shí)驗(yàn)研究的是一種新的MSCs,即人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, HUMSCs)。通過從臍帶中成功提取出HUMSCs,并研究其生物特性,為后期HUMSCs的定向分化奠定基礎(chǔ)。 研究方法:無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,無菌鹽水將臍帶清洗后,用組織剪將臍帶組織剪碎成2~4cm長度大小,清洗臍帶血,人工剝離臍帶片段上的動(dòng)靜脈血管,剪碎臍帶,加入膠原酶Ⅱ消化,細(xì)胞篩過濾,收集濾液,離心,用DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸分離所得細(xì)胞,接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時(shí),進(jìn)行消化傳代和擴(kuò)增培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)的變化,通過生長曲線的描繪觀察其增殖能力,流式細(xì)胞儀對其免疫表型進(jìn)行檢測。 結(jié)果:組織消化第2天,可見少量形態(tài)各異的細(xì)胞貼壁,細(xì)胞形態(tài)較小,未見明顯的細(xì)胞核,大部分未消化的組織塊懸浮于培養(yǎng)液表面。隨著時(shí)間延長,貼壁的細(xì)胞越來越多。4天后,可見部分貼壁細(xì)胞呈扁平狀或長梭形,并有兩個(gè)突起,約8天后,貼壁細(xì)胞明顯增多,可見典型的長梭形成纖維樣細(xì)胞,并呈漩渦狀生長,至14天左右時(shí)達(dá)到80%融合。經(jīng)過傳代培養(yǎng),可得到逐漸純化的HUMSCs,同時(shí),細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,性質(zhì)穩(wěn)定,至少能傳代20代以上。對原代及第3、7、14代HUMSCs的增殖能力檢測,通過生長曲線描繪,發(fā)現(xiàn)第3、7、14代HUMSCs生長曲線有共同的特性,14代以內(nèi)的細(xì)胞生長曲線無明顯差別,增殖能力大致相似。同時(shí)分別對第3、7、10代HUMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測。結(jié)果顯示這三代細(xì)胞免疫表型均無明顯差異,CD29、CD73、CD105均呈陽性表達(dá),陽性率分別為99.2%、99.5%、98.9%,而CD34、CD45及HLA-DR均表達(dá)率分別為0.1%、0.5%、0.2%。 結(jié)論:臍帶是分娩后的棄物,來源豐富,取材方便,不存在倫理道德問題。通過酶消化法可以從臍帶中獲得HUMSCs,該細(xì)胞是一種成纖維樣細(xì)胞,具有較強(qiáng)的增殖能力,免疫表型檢測顯示其表達(dá)整合素受體、基質(zhì)細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志,而造血干細(xì)胞標(biāo)志及MHC-Ⅱ類抗原均呈極低表達(dá)。說明HUMSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞,而且免疫原性低。因此,HUMSCs作為一種新型間充質(zhì)干細(xì)胞,具有干細(xì)胞的特性,是組織工程研究中理想的種子細(xì)胞來源。 研究背景和目的:MSCs具有多向分化的能力,已經(jīng)證實(shí)其可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。同樣,HUMSCs具有一定的可塑性,在不同條件下HUMSCs亦能被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞,分化后的細(xì)胞能表達(dá)特殊的神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白。但在不同的誘導(dǎo)條件下,誘導(dǎo)效率不同,雖然均能向神經(jīng)細(xì)胞方向分化,但神經(jīng)元表達(dá)率相對較高,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)率較低。因此,本研究通過在體外特殊誘導(dǎo)環(huán)境下,使HUMSCs向神經(jīng)上皮樣細(xì)胞分化,特別是向少突膠質(zhì)樣細(xì)胞分化,為后期神經(jīng)系統(tǒng)疾病的修復(fù)與治療提供理想的細(xì)胞源,比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的治療。 研究方法:HUMSCs在體外DMEM/F12、N2添加劑、胰島素、bFGF及EGF等誘導(dǎo)液作用下24小時(shí),換分化液包括DMEM/F12、N2添加劑及IGF-I,觀察分化后細(xì)胞形態(tài)變化,并通過免疫熒光方法檢測分化后的神經(jīng)上皮樣細(xì)胞特異性標(biāo)記如神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物:巢蛋白Nestin,神經(jīng)元特異性標(biāo)志物:微管蛋白β-TubulinⅢ,星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物:神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP,少突膠質(zhì)細(xì)胞早期祖細(xì)胞標(biāo)記物:A2B5,少突膠質(zhì)細(xì)胞晚期祖細(xì)胞標(biāo)記物:O4,成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物:堿性髓鞘蛋白MBP及少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Olig2。 結(jié)果:在IGF-1等多種細(xì)胞生長因子聯(lián)合作用下HUMSCs能向神經(jīng)上皮樣細(xì)胞分化,分化后的細(xì)胞形態(tài)有明顯的變化,同時(shí)還能不同程度的表達(dá)Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP、MBP、A2B5、O4及Olig2,并隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的不同,分化后細(xì)胞所表達(dá)的熒光強(qiáng)度有所變化,混合細(xì)胞所含的成分亦不相同。分化后第8天為神經(jīng)元及成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的明顯界線,8天前神經(jīng)元的成分相對較多,而8天后成熟少突膠質(zhì)樣細(xì)胞增多。 結(jié)論:HUMSCs在體外IGF-1等多種細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)下首先向神經(jīng)前體細(xì)胞分化,再逐漸向神經(jīng)元樣細(xì)胞、少突膠質(zhì)樣細(xì)胞及星形膠質(zhì)樣細(xì)胞等神經(jīng)上皮樣細(xì)胞分化。少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟經(jīng)歷了從早期祖細(xì)胞到晚期祖細(xì)胞再到成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的過程。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 楊晨;顏煒群;;間充質(zhì)干細(xì)胞分離提取的優(yōu)化方法[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年03期

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本文編號：1714700