發(fā)布時間：2018-04-05 03:33

  本文選題：血管性癡呆　切入點：兩血管阻斷法　出處：《河北醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的：血管性癡呆（vascular dementia, VD）是由一系列腦血管因素（缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等）導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的癡呆綜合征。在我國VD居老年性癡呆的首位，且隨著人口的老齡化，VD的發(fā)病呈上升趨勢。但目前VD的發(fā)病機制尚不清楚，也無特效的防治方法。因此，建立理想的VD動物模型對于探討其發(fā)病機制以及研發(fā)防治VD的藥物有著重要的意義。 近年來的研究表明，頸部血管逐漸狹窄引起的長期慢性腦供血不足是VD形成的重要原因之一。模擬此發(fā)病機制的兩血管阻斷（two-vesselocclusion，2-VO）法，是目前研究VD常用的方法。但由于大腦動脈環(huán)的代償作用和側(cè)枝循環(huán)的建立，常難以達到理想的腦缺血效果，且動物的死亡率較高，從而影響模型的穩(wěn)定性和應用。若能基于2-VO法的原理進行改良，既能提高模型的穩(wěn)定性，又能降低動物的死亡率，則可能是較為理想的VD動物模型。 穿梭箱實驗（shuttle box test）用于檢測實驗動物條件性學習記憶能力，反映動物主動逃避反應，能較客觀準確地顯示實驗動物的癡呆程度。海馬與學習記憶密切相關(guān)，且對腦缺血敏感。觀察海馬的形態(tài)學改變，可進一步從病理學角度驗證模型的穩(wěn)定性。 因此，本實驗采用四種不同的改良2-VO法復制VD動物模型，動態(tài)觀察不同模型小鼠穿梭箱實驗的行為學變化以及海馬的病理學改變，從而評價出較理想的VD小鼠模型，為VD的防治研究提供新的依據(jù)。 1動物分組及方法 將128只昆明小鼠（28-32g）隨機分為： ①正常對照組（n=8） 小鼠不做任何處理，進行穿梭箱實驗。 ②Sham組（n=24） 游離雙側(cè)頸總動脈，但不夾閉，不進行尾部放血，于術(shù)后15天、30天和45天分別進行穿梭箱實驗（每個時間點8只動物）。 ③模型1組（n=24） 夾閉雙側(cè)頸總動脈20min，再灌10min，反復3次，同時尾部放血0.3ml。于術(shù)后15天、30天和45天分別進行穿梭箱實驗（每個時間點8只動物）。 ④模型2組（n=24） 夾閉雙側(cè)頸總動脈30min，再灌10min，反復3次，同時尾部放血0.3ml。其余同模型1組。 ⑤模型3組（n=24） 左側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎，右側(cè)頸總動脈夾閉30min，再灌10min，反復3次。其余同模型1組。 ⑥模型4組（n=24） 右側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎，左側(cè)頸總動脈夾閉30min，再灌10min，反復3次。其余同模型1組。 2VD模型的制備 將小鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈。在模型1和2中，以動脈夾阻斷雙側(cè)頸總動脈血流20或30min，再灌10min，反復3次；同時在距鼠尾尖約1cm處斷尾，放血約0.3ml。在模型3和4中，用絲線永久性結(jié)扎左側(cè)或右側(cè)頸總動脈以阻斷血流；同時以動脈夾阻斷對側(cè)頸總動脈血流30min，再灌10min，反復3次；不進行尾部放血。假手術(shù)組分離雙側(cè)頸總動脈，但不阻斷血流，不進行尾部放血，其它步驟與模型組相同。 3穿梭箱實驗測定行為學變化 實驗裝置為一44×28×23cm3的穿梭箱，箱底為可通電的銅柵。第一天將小鼠放入穿梭箱，適應10min。第二天按前一天的順序?qū)⑿∈蠓湃氪┧笙渲袦y定。測定方法為在10s蜂鳴（條件刺激）之后，產(chǎn)生一個1.0mA的交流電刺激，最長持續(xù)10s。如果小鼠在蜂鳴刺激過程中，就移動到穿梭箱另一頭，則記為一次主動逃避反應。如果小鼠在電擊后，，移動到穿梭箱另一頭，則記為一次被動逃避反應。每只動物連續(xù)進行60次循環(huán)實驗，每次間隔40s，以10次循環(huán)為一組，即共有6組循環(huán)，統(tǒng)計每10次實驗中動物的電擊時間和主動逃避的反應率。每組循環(huán)間，小鼠休息60s后，進入下組循環(huán)。 4病理學觀察海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡 各組動物均在穿梭箱實驗測定后24h斷頭取材，常規(guī)腦組織切片，硫堇染色，在光學顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)，確定錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡（delayed neuronal death，DND）情況。計數(shù)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片計數(shù)3個區(qū)段，取平均數(shù)為神經(jīng)元密度（neuronal density，ND）。根據(jù)以下標準確定組織學分級（histological grade，HG）：0級，無神經(jīng)元死亡；Ⅰ級，散在神經(jīng)元死亡；Ⅱ級，成片神經(jīng)元死亡；Ⅲ級，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。 5結(jié)果 5.1穿梭箱實驗行為學結(jié)果 5.1.1同一VD模型不同時間點小鼠行為學的變化 ①模型1：與sham組相比，模型組小鼠15天和30天電擊時間明顯增加（P0.05），而45天時無統(tǒng)計學差異；模型組15天與30天電擊時間無統(tǒng)計學差異，但15天比45天電擊時間明顯延長（P0.05），表明該模型小鼠15天時條件性學習記憶能力下降最明顯，隨后逐漸恢復。②模型2：該模型組小鼠在15天、30天和45天時電擊時間均較sham組明顯增加（P0.05），且各組間無差異，表明該模型小鼠條件性學習記憶能力下降較明顯且持續(xù)時間較長。③模型3：與sham組相比，模型組小鼠15天、30天和45天電擊時間均明顯增加（P0.05），且各組間無差異，表明該模型小鼠條件性學習記憶能力下降較明顯且持續(xù)時間較長。④模型4：該模型組小鼠在15天和30天時電擊時間較sham組明顯增加（P0.05），但45天時無統(tǒng)計學差異；模型組15天與30天時電擊時間無顯著性差異，而15天和30天均比45天電擊時間明顯延長（P0.05），表明該模型小鼠條件性學習記憶能力下降以15天和30天較明顯，隨后逐漸恢復。 5.1.2同一時間點不同VD模型小鼠行為學的比較 15天和30天時，與sham組相比，各模型組電擊時間均明顯延長（P0.05），且各組間無統(tǒng)計學差異；表明各VD模型小鼠均出現(xiàn)了明顯的條件性學習記憶能力降低。45天時，模型2和3組電擊時間均較sham組增加（P0.05），但模型2和3組間無統(tǒng)計學差異；表明這2個VD模型小鼠仍有學習記憶能力的下降；而模型1和4組電擊時間與sham組相比均無顯著性差異，表明這2個VD模型小鼠學習記憶能力的下降逐漸恢復。 5.2病理學結(jié)果 5.2.1同一VD模型不同時間點小鼠海馬CA1區(qū)病理學結(jié)果 ①模型1：正常和sham組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞3~5層，排列整齊致密，細胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，無細胞缺失。此模型組海馬CA1區(qū)DND明顯；與sham組相比，15天、30天和45天均有HG明顯升高，ND顯著降低（P0.05），并且各時間點組間無統(tǒng)計學差異。表明該模型可導致小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量減少，但損傷沒有隨時間而加重。②模型2：與sham組相比，此模型組在15天、30天和45天均有HG顯著升高，ND顯著降低（P0.05），且模型組的45天較15天ND降低更明顯（P0.05），表明該模型小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞的損傷隨時間進行性加重。③模型3：與sham組相比，此模型組在15天、30天和45天均有HG明顯升高，ND顯著降低（P0.05），同時各時間點組間無統(tǒng)計學差異。表明該模型可導致小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量減少，但損傷沒有隨時間而加重。④模型4：該模型小鼠海馬CA1區(qū)變化與模型3相似。 5.2.2同一時間點不同VD模型小鼠海馬CA1區(qū)病理學結(jié)果 與sham組相比，各模型組小鼠海馬CA1區(qū)均有HG明顯升高，ND顯著降低（P0.05）。在15天和30天各模型組間無顯著性差異。但在45天時，模型2和4組均較模型1組ND顯著降低（P0.05），說明雙側(cè)頸總動脈夾閉30min組及右側(cè)結(jié)扎組均較雙側(cè)頸總動脈夾閉20min組錐體細胞損傷嚴重。而模型2組較模型3組，ND顯著降低（P0.05），說明雙側(cè)頸總動脈夾閉30min組較左側(cè)結(jié)扎組錐體細胞損傷嚴重。 6結(jié)論 ⑴四種不同的改良2-VO法復制的VD模型均可使小鼠的條件性學習記憶能力下降，海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)DND。 ⑵模型1（雙側(cè)頸總動脈夾閉20min+尾部放血）和模型4（右側(cè)頸總動脈結(jié)扎+左側(cè)頸總動脈夾閉）可能較適合于主動逃避反應的短期觀察；而模型2（雙側(cè)頸總動脈夾閉30min+尾部放血）和模型3（左側(cè)頸總動脈結(jié)扎+右側(cè)頸總動脈夾閉）可能較適合于主動逃避反應的長期觀察。
[Abstract]:Objective : Vascular dementia ( VD ) is a dementia syndrome characterized by a series of cerebrovascular factors ( ischemia , hemorrhage , acute and chronic hypoxic cerebrovascular disease , etc . ) .

The two - vessel occlusion ( 2 - VO ) method is one of the important causes of VD formation in the long term chronic cerebral blood supply caused by the narrowing of the neck vessels . However , the two - vessel occlusion ( 2 - VO ) method is a common method for VD . However , the method can improve the stability of the model and reduce the mortality of the animals .

The shuttle box test is used to detect the conditioned learning and memory ability of experimental animals and reflect the active avoidance response of the animals . The hippocampus is closely related to the learning and memory and is sensitive to cerebral ischemia . The morphological changes of the hippocampus can be observed , and the stability of the model can be further verified from the pathology angle .

Therefore , four different modified 2 - VO methods were used to replicate VD animal models , and the behavioral changes and pathological changes of hippocampus were observed .

1 Animal grouping and method

128 Kunming mice ( 28 - 32 g ) were randomly divided into :

( 1 ) Normal control group ( n = 8 )

The mice did not do any treatment and carry out the shuttle box experiment .

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本文編號：1713029