本文選題：丙型肝炎病毒　切入點：高變區(qū)1　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)為單股正鏈RNA病毒,黃病毒科成員,是經(jīng)血液傳播而引起急、慢性肝炎的主要致病因子之一。目前全球約有1.7億人感染HCV,每年新發(fā)感染者約300萬例。HCV慢性感染率高達70%以上,HCV慢性感染在發(fā)達國家是導(dǎo)致肝硬化、肝細胞癌等終末期肝病的主要原因。HCV感染還與多種肝外疾病,如淋巴瘤、混合性冷球蛋白血癥、腎小球腎炎、遲發(fā)性皮膚卟啉癥、糖尿病等密切相關(guān)。 目前全球范圍內(nèi)經(jīng)血液以及血制品途徑感染的丙型肝炎病例與上世紀九十年代以前相比有大幅下降,但在發(fā)展中國家血液和血制品仍然是傳播HCV的重要途徑。此外,每年散發(fā)性以及傳播途徑不明的丙型肝炎新發(fā)病例在全球范圍內(nèi)仍高居不下�？刂艸CV感染的關(guān)鍵措施還依賴于開發(fā)出有效的疫苗。從1989年HCV基因組被克隆以來,丙型肝炎疫苗的研究在歐美和日本等發(fā)達國家一直是研究熱點,但迄今未有有效的疫苗問世。 HCV包膜E2蛋白是介導(dǎo)HCV細胞侵入的關(guān)鍵蛋白,該蛋白氨基末端的27個氨基酸是第一個鑒定出的含中和抗體表位的區(qū)域,因其序列高變而被稱為高變區(qū)1(hypervariable Region 1,HVR1),HVRl的高度變異曾被認為是遏制丙肝疫苗發(fā)展的瓶頸問題。然而,近幾年來基于感染性假HCV顆粒(HCVpp)以及細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(HCVcc)的中和試驗表明,HVRl并不是唯一的中和抗體表位所在區(qū)域,在HCV包膜E2蛋白中還存在保守的空間構(gòu)象和線性中和抗體表位。 本實驗室之前研究HVR1免疫特性時發(fā)現(xiàn):HVR1具有強免疫原性,可高效誘導(dǎo)中和抗體,同時,HVR1非常顯著地抑制HCV包膜E2蛋白中保守抗原表位的抗體應(yīng)答。 本研究中,我們進一步從免疫原性和蛋白結(jié)構(gòu)等方面分析HVR1免疫誘餌作用的可能機制,并鑒定出其中的關(guān)鍵氨基酸序列,為認識HCV免疫逃避以及HCV細胞侵入機制提供全新信息,為HCV疫苗的研究提出全新思路。 一、HVR1中抑制E2蛋白免疫原性的關(guān)鍵肽段的鑒定 方法:1、質(zhì)粒構(gòu)建:以1a基因型H77株HCV包膜蛋白基因為原型,構(gòu)建HVR1中部分氨基酸殘基缺失的各種分泌型E2蛋白表達質(zhì)粒,包括缺失整個HVR1(77Δ)、缺失HVR1第1至12位氨基酸殘基(77Δ1-12)、缺失第13至27位氨基酸殘基(77Δ13-27)、缺失第16至24位氨基酸殘基(77Δ16-24)以及含完整HVR1(77)的5種質(zhì)粒。2、E2蛋白表達檢測:用ELISA、Western blot和免疫熒光檢測各種E2蛋白的表達和分泌。3、DNA免疫:將上述質(zhì)粒肌肉注射免疫Balb/C小鼠。4、抗體檢測:用ELISA和免疫熒光檢測小鼠血清中的E2Δ抗體、HVR1抗體以及三個已知B細胞表位(412、522、432)的反應(yīng)。 結(jié)果:缺失HVR1或其中的部分殘基對E2蛋白的表達、分泌及構(gòu)象無明顯影響。含有HVR1或HVR1第16-24位氨基酸的質(zhì)�？擅庖咝∈笳T導(dǎo)產(chǎn)生HVR1抗體,同時抑制E2蛋白中其他表位的抗體應(yīng)答,而去除第16-24位氨基酸即可消除這種抑制作用。 結(jié)論:高變區(qū)1中的16-24位氨基酸為抑制E2蛋白免疫原性的關(guān)鍵肽段,而該肽段是我們前期鑒定出的H77株HVR1中的唯一B細胞表位。 二、HVR1抑制HCV包膜E2蛋白免疫原性的機制研究 方法:1、構(gòu)建質(zhì)粒:將HVR1移位到E2蛋白羧基末端(77Δ-HC)、在E2羧基末端增加HVR1肽段(77-HC);將HVR1與HBsAg串聯(lián)(S-HN);將HVR1替換為其他抗原表位HA表位(77HA)。2、將各重組質(zhì)粒免疫小鼠。3、檢測小鼠產(chǎn)生的HVR1抗體、HA抗體、E2抗體以及HBsAg抗體,分析各種抗體水平之間的相關(guān)性。 結(jié)果:1、HVR1的定位不影響其對E2免疫原性的抑制作用。2、HVR1可抑制HBsAg誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答。3、HA表位也能抑制E2的免疫原性。 結(jié)論: HVR1是免疫優(yōu)勢表位,可抑制HBsAg的免疫原性;E2蛋白其他區(qū)域的免疫原性易受HVR1以及HA表位的影響,導(dǎo)致誘導(dǎo)抗體的能力降低。 三、免疫血清對病毒的中和作用研究 方法:1、將幾種代表性質(zhì)粒(77、77Δ、77Δ13-27)用肌肉注射聯(lián)合電脈沖免疫新西蘭大白兔。2、檢測兔血清抗體。3、純化兔血清中的IgG,分析IgG對HCVpp以及HCVcc的中和活性。 結(jié)果: 1、質(zhì)粒77能誘導(dǎo)E2抗體,但其中針對HVR1的抗體占絕對優(yōu)勢;以E2Δ作為抗原檢測兔血清,則質(zhì)粒77Δ、77Δ13-27誘導(dǎo)的抗體顯著強于77;2、用不同基因型E1E2為抗原檢測兔血清抗體,表明缺失HVR1能顯著提高E2蛋白誘導(dǎo)交叉中和抗體;3、HCVpp中和試驗表明,77免疫血清的中和作用主要依賴于HVR1抗體,缺失HVR1或HVR1的第13-27位氨基酸能顯著促進E2誘導(dǎo)交叉中和抗體。 結(jié)論:免疫兔得到的結(jié)果與免疫小鼠得到的結(jié)論是一致的,即HVR1顯著抑制E2蛋白中其他抗體表位的免疫原性,用缺失HVR1或HVR1中第13-27位氨基酸的E2蛋白可能是一種有效的丙型肝炎疫苗抗原,其發(fā)展前景值得期待。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 殷霄;王文;譚文杰;鄧瑤;管潔;文波;陳紅;阮力;;融合表達DEC 205單鏈抗體和NS3蛋白的HCV DNA疫苗的免疫原性研究[J];病毒學(xué)報;2011年01期

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1 羅源;丙型肝炎病毒高變區(qū)1對HCV E2蛋白免疫原性抑制作用研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

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本文編號：1681627