本文選題：Marf　切入點(diǎn)：In-Fusion克隆　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》2017年07期

【摘要】：目的:克隆小鼠的Marf1基因并使其在真核細(xì)胞HEK293T中異位表達(dá),以研究MARF1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)和定位。方法:運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增并獲得Marf1基因編碼序列,再利用新型分子克隆體系In-Fusion將該目的片段克隆至pCMV6-AC-3DDK和pCMV6-AN-m Kate兩個真核表達(dá)載體中,由此所得融合質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切電泳和測序篩選鑒定,將所得到的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),然后利用DDK和m Kate標(biāo)簽抗體通過Western blot或免疫熒光的方法檢測目的蛋白MARF1的表達(dá)和定位。結(jié)果:DNA測序鑒定證明Marf1基因克隆成功;Western blot檢測到MARF1-3DDK和MARF1-m Kate融合蛋白在轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);免疫熒光顯示融合蛋白在轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞質(zhì)呈顆粒狀分布,并與紡錘體共定位。結(jié)論:成功克隆了小鼠Marf1基因并實(shí)現(xiàn)了其在真核細(xì)胞HEK293T中的穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步研究其功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to clone mouse Marf1 gene and its expression in eukaryotic cells of ectopic HEK293T, to study the MARF1 protein in the cell expression and localization. Methods: using reverse transcription polymerase chain reaction (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) were amplified and obtained the Marf1 gene encoding sequence, using novel molecular cloning system In-Fusion the fragment was cloned into pCMV6-AC-3DDK pCMV6-AN-m and Kate two eukaryotic expression vector, the resulting fusion plasmid by restriction endonuclease digestion and sequencing identification, the positive plasmid transfected into HEK293T cells, and then use DDK and m Kate tag antibody through expression and localization of blot or Western immunofluorescence detection of MARF1 protein. Results: DNA sequencing proved that the Marf1 gene was cloned successfully; Western blot detected MARF1-3DDK and MARF The expression of 1-m Kate fusion protein in transfected HEK293T cells; immunofluorescence showed that the fusion protein was granular distribution in the transfected HEK293T cytoplasm and colocalized with spindle. Conclusion: cloned mouse Marf1 gene and its realization in eukaryotic cells in HEK293T stable expression, which lays the foundation for further study the function and mechanism of action.

【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家重大科學(xué)研究計(jì)劃(2014CB943200,2013CB945500) 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471351,31271538) 江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140061)
【分類號】：R3416

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本文編號：1669990