本文選題：斑馬魚　切入點(diǎn)：Tol2基因捕獲　出處：《清華大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：出生缺陷嚴(yán)重危害人類健康。全世界人類出生缺陷率在3~4%之間，，且居高不下。大部分出生缺陷是遺傳和環(huán)境因素的綜合結(jié)果，如染色體異常、單基因突變以及環(huán)境致畸因素的影響。為了研究調(diào)控胚胎早期發(fā)育的重要基因，我們利用斑馬魚作為模式生物開展了相關(guān)工作。在本課題中，我們進(jìn)行了Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲及突變體篩選，并利用突變體對(duì)被捕獲基因的功能及分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。 本課題共篩選出195個(gè)轉(zhuǎn)基因家系，大部分熒光在母源和合子期都表達(dá)。其中，約40個(gè)家系熒光表達(dá)有時(shí)空特異性，其余為全身性表達(dá)。篩選到4個(gè)突變體，且都是合子純合隱性突變體。 本課題主要對(duì)nup107tsu068Gt突變體家系進(jìn)行了深入研究。該家系中，EGFP在母源和合子期都表達(dá)，早期表現(xiàn)為全身性表達(dá)，24hpf后逐漸集中在頭部和腸道區(qū)域。Tol2轉(zhuǎn)座子插入至斑馬魚nucleoporin107（nup107）基因第一個(gè)內(nèi)含子中，破壞了野生型轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。純合體從3dpf開始表現(xiàn)出組織特異性發(fā)育缺陷，包括咽弓軟骨缺失、腸道和眼變小、魚鰾消失等表型，純合體在5~6dpf之間死亡。野生型胚胎中用反義嗎啉環(huán)寡核苷酸敲低nup107的表達(dá)，胚胎顯示出與突變體類似的表型，表明nup107缺失直接導(dǎo)致了突變表型。在發(fā)育缺陷的組織中，細(xì)胞過量凋亡，并且這些細(xì)胞凋亡部分依賴p53信號(hào)通路。在受影響的細(xì)胞中，F(xiàn)G-repeat核孔蛋白定位紊亂，核孔數(shù)量減少，mRNA出核受到抑制，但蛋白入核不受影響。在有絲分裂細(xì)胞中，nup107缺失并未影響紡錘體的裝配和染色單體的分離。同時(shí)，細(xì)胞周期和增殖也是正常的。另一方面，nup107tsu068Gt突變體中γ-H2A.X水平顯著上調(diào)，表明DNA雙鏈缺口的大量積累。突變體對(duì)紫外輻射和hydroxyurea（一種DNA復(fù)制抑制劑）高度敏感，顯示nup107在修正DNA復(fù)制錯(cuò)誤以及維持基因組穩(wěn)定和完整性中發(fā)揮作用。同時(shí)， DNA損傷應(yīng)答ATM-Chk2-p53通路被上調(diào)。我們認(rèn)為nup107缺失破壞了核孔復(fù)合體裝配和功能，同時(shí)使DNA損傷得不到有效修復(fù)，二者共同造成了特異組織的細(xì)胞凋亡。本研究第一次報(bào)道了nup107在脊椎動(dòng)物中的功能和分子機(jī)制。
[Abstract]:Birth defects are a serious hazard to human health. The rate of human birth defects is between 3 and 4 per cent worldwide and remains high. Most birth defects are the result of a combination of genetic and environmental factors, such as chromosomal abnormalities, Single gene mutation and environmental teratogenic factors. In order to study the important genes regulating early embryonic development, we used zebrafish as a model organism to carry out related work. Tol2 transposon mediated gene capture and mutants screening were carried out, and the function and molecular mechanism of the captured genes were studied by using the mutants. A total of 195 transgenic families were screened in this study, most of which were expressed in the mother and daughter stages. Among them, about 40 families had space-time specific fluorescence expression, and the rest were systemic. Four mutants were screened. All of them were homozygous recessive mutants. In this study, we studied the nup107tsu068Gt mutants in the pedigree. In the early stage, after 24 HPF, the transposon of Tol2 was inserted into the first intron of the nucleoporin 107 nup107) gene in zebrafish. Homozygote showed tissue specific developmental defects from 3dpf, including loss of pharyngeal arch cartilage, small intestine and eyes, disappearance of swim bladder, and so on. Homozygote died between 5~6dpf. In wild type embryos, antisense morpholine ring oligonucleotides were used to knock down the expression of nup107. The embryos showed a phenotype similar to that of mutants, indicating that nup107 deletion directly resulted in mutant phenotypes. The apoptosis of these cells partly depends on p53 signaling pathway. In the affected cells, the localization of nuclear pore protein of FG-repeat is disordered, and the decrease of nuclear pore number is inhibited. The deletion of nup107 in mitotic cells did not affect the assembly of spindle and the separation of chromatid. At the same time, cell cycle and proliferation were normal. On the other hand, the level of 緯 -H2A.X in nup107tsu068Gt mutant was significantly up-regulated. The results showed that the DNA double strand gap accumulated a lot. The mutants were highly sensitive to ultraviolet radiation and hydroxyurea (a DNA replication inhibitor). The results show that nup107 plays a role in correcting DNA replication errors and maintaining genomic stability and integrity. At the same time, the ATM-Chk2-p53 pathway of DNA damage response is up-regulated. We believe that nup107 deletion destroys the assembly and function of nuclear pore complexes. At the same time, the damage of DNA could not be repaired effectively, and both of them caused apoptosis of specific tissues. In this study, the function and molecular mechanism of nup107 in vertebrates were reported for the first time.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R3411

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1670462