本文選題：HPV16　切入點：E2蛋白　出處：《南華大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的：構(gòu)建人乳頭瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白及其N端結(jié)構(gòu)域（TAD）和C端結(jié)構(gòu)域（DBD）與綠色熒光蛋白（GFP）融合蛋白真核表達(dá)載體，觀察融合蛋白在Hela細(xì)胞或巨噬細(xì)胞（MΦ）中的定位。研究HPV16E2蛋白及其TAD、DBD對MΦ分泌TNF-α和IL-1β及細(xì)胞凋亡率的影響。 方法： (1)用Primer5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增HPV16E2及其TAD、DBD基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后與pEGFP-C1載體相應(yīng)酶切位點連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)酶切和測序鑒定，篩選陽性克隆，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-C1/HPV16E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD。 (2)將質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD各0.5μg分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞或MΦ。36h后，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP-HPV16E2、GFP-HPV16E2TAD、GFP-HPV16E2DBD在Hela細(xì)胞或MΦ中的分布及定位。 (3)用佛波酯（PMA）誘導(dǎo)THP-1為MΦ；將MΦ分為空白組、GFP組、GFP-E2組、GFP-E2TAD組及GFP-E2DBD組。除空白組外，每組分別轉(zhuǎn)染0.5μgpEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD。轉(zhuǎn)染48h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液, ELISA測定TNF-α和IL-1β的含量；收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測MΦ凋亡。 結(jié)果： (1) PCR產(chǎn)物分別連接至pEGFP-C1載體上后，雙酶切及測序結(jié)果表明目的片段與HPV16E2、TAD、DBD基因正確連接入pEGFP-C1。真核表達(dá)載體pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞或MΦ后，GFP-DBD融合蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，GFP-TAD定位于細(xì)胞漿，GFP-E2、GFP在細(xì)胞核、漿內(nèi)均有表達(dá)，但GFP-E2表達(dá)組細(xì)胞核熒光亮度強于細(xì)胞漿。 (2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MΦ48h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β的含量GFP-E2組(321.83±22.00，，214.35±22.79)、GFP-TAD組(371.79±22.73，233.52±17.75)明顯高于GFP組(265.74±28.74,167.60±18.68)和空白組(234.76±31.94,155.13±20.54)（P0.05），且GFP-TAD組與GFP-E2組TNF-α濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；GFP-TAD組IL-1β含量略高于GFP-E2組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）；GFP-DBD(265.74±28.74，167.60±18.68)與GFP組或空白組TNF-α及IL-1β含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 (3)在MΦ凋亡率檢測中，GFP-E2組(11.53±0.54)、GFP-TAD組(14.57±0.59)明顯高于GFP組(4.53±0.37)或空白組(5.20±0.65)（P0.05），且GFP-TAD組MΦ凋亡率高于GFP-E2組（P0.05）；但GFP-DBD組(4.92±0.49)與GFP組或空白組比較，MΦ凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論： (1)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-C1/HPV16E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD均能在Hela細(xì)胞或MΦ中表達(dá)，GFP-DBD定位于細(xì)胞核，GFP-TAD定位細(xì)胞漿。 (2) HPV16E2及其TAD即時高表達(dá)上調(diào)MΦ分泌TNF-α和IL-1β。 (3) HPV16E2及其TAD即時高表達(dá)可誘導(dǎo)MΦ凋亡。
[Abstract]:Aim: to construct the eukaryotic expression vector of the fusion protein of HPV16 E 2 and its N-terminal domain TAD and C-terminal domain of human papillomavirus 16 (HPV16) with green fluorescent protein (GFP). To observe the localization of the fusion protein in Hela cells or macrophages, and to study the effects of HPV16E2 protein and tadd DBD on the secretion of TNF- 偽 and IL-1 尾 and the apoptosis rate of M 桅. Methods:. 1) primers were designed with Primer5.0 primer design software. The PCR products were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were digested with the corresponding restriction sites of pEGFP-C1 vector and transformed into E.coli JM109. The positive clones were screened by restriction enzyme digestion and sequencing. The eukaryotic expression vector pEGFP-C1 / HPV16E2pEGFP-C1 / tat and pEGFP-C1 / DBDrespectively were constructed. (2) the plasmid pEGFP-C1pEGFP-C1 / E2pEGFP-C1 / pEGFP-C1 / TAD1 / pEGFP-C1 / DBD was transfected into Hela cells or M 桅. 36 h later, the distribution and localization of GFP-HPV16E2TADD in Hela cells or M 桅 were observed under inverted fluorescence microscope. (3) THP-1 was induced to be M 桅 by PMA, and M 桅 was divided into two groups: GFP-E2TAD group and GFP-E2DBD group. With the exception of blank group, each group was transfected with 0.5 渭 g pEGFP-C1 / E2pEGFP-C1 / E2pEGFP-C1pEGFP-C1 / DBD.After transfection, the supernatant of cell culture was taken, and the contents of TNF- 偽 and IL-1 尾 were measured by ELISA. Apoptosis of M 桅 was detected by flow cytometry (FCM). Results:. 1) the PCR product was ligated to the pEGFP-C1 carrier, The results of double enzyme digestion and sequencing showed that the target fragment was correctly ligated into pEGFP-C1.The eukaryotic expression vector pEGFP-C1 / E2pEGFP-C1pTAD and pEGFP-C1/DBD were transfected into Hela cells or M 桅, respectively. However, the nuclear fluorescence intensity of GFP-E2 expression group was stronger than that of cytoplasm. The content of TNF- 偽 IL-1 尾 in the supernatant of cell culture in GFP-E2 group was 321.83 鹵22.00214.35 鹵22.79TP-TAD group 371.79 鹵22.73233.52 鹵17.75, which was significantly higher than that in GFP group (265.74 鹵28.74167.60 鹵18.68) and blank group (234.76 鹵31.94155.13 鹵20.54P0.05), and there was a significant difference between GFP-TAD group and GFP-E2 group in TNF- 偽 concentration. The content of IL-1 尾 in GFP-TAD group was slightly higher than that in GFP-E2 group. However, there was no significant difference in the contents of TNF- 偽 and IL-1 尾 between the GFP group and the control group (265.74 鹵28.74167.60 鹵18.68). (3) the apoptosis rate of M 桅 in GFP-E2 group (11.53 鹵0.54) was significantly higher than that in GFP group (4.53 鹵0.37) or blank group (5.20 鹵0.65), and the apoptosis rate of M 桅 in GFP-TAD group was higher than that in GFP-E2 group, but there was no significant difference between GFP-DBD group and GFP group or blank group. Conclusion:. The constructed eukaryotic expression vector pEGFP-C1 / HPV16E2pEGFP-C1 / TADPEGFP-C1 / DBD could express GFP-DBD in Hela cells or M 桅. 2) the overexpression of HPV16E2 and its TAD up-regulated the secretion of TNF- 偽 and IL-1 尾 by M 桅. High expression of HPV16E2 and TAD could induce apoptosis of M 桅.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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本文編號：1661497