本文選題：TRA2B蛋白　切入點：組織特異性　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：TRA2B (transformer2beta homolog, Drosophila)是一種SR(Serine/Arginine-rich proteins)相關(guān)蛋白,主要參與調(diào)控前體mRNA剪接,從而調(diào)節(jié)基因表達。有許多證據(jù)表明TRA2B在大腦中廣泛分布、參與多種腦生理功能,并與一些腦疾病相關(guān)。本論文的總目標是在本課題組以往工作基礎(chǔ)上,進一步了解TRA2B在大腦中的可能作用。在第一部分工作中,我們用Western Blot、免疫組織化學(xué)和免疫熒光等方法詳細分析了成年大鼠腦內(nèi)不同區(qū)域和核團中TRA2B的表達特征,如表達水平、核質(zhì)分布、細胞類型特異性等。我們在大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)TRA2B蛋白有兩種翻譯后修飾形式,其中磷酸化形式與其細胞核分布相關(guān)聯(lián)。此外,雖然TRA2B,總蛋白在大鼠腦各個組織廣泛分布,但是總蛋白水平在各腦區(qū)不同,而且其磷酸化和非磷酸化狀態(tài)的比例也不同,具有區(qū)域特異性。我們還發(fā)現(xiàn)TRA2B蛋白的免疫信號廣泛存在于神經(jīng)元細胞中,而在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中檢測不到,說明TRA2B在腦內(nèi)的表達有細胞特異性。在亞細胞分布上我們還發(fā)現(xiàn)TRA2B蛋白在細胞核內(nèi)呈斑點狀分布。 我們還發(fā)現(xiàn)TRA2B蛋白在嗅球、上丘腦、下丘腦、中腦、小腦浦肯野細胞和顆粒細胞中均有表達。尤其值得注意的是,我們觀察到TRA2B在一些核團如前額葉皮層(PFC)、伏隔核(NAc)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)、藍斑區(qū)(LC)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(CGD)和被蓋腳橋核(RtTg)有著顯著表達,這些核團都是已知的與藥物成癮及耐受有著密切聯(lián)系的區(qū)域。這些結(jié)果提示了TRA2B與藥物成癮很可能有一定的聯(lián)系。鑒于TRA2B是一個重要的基因表達調(diào)控蛋白,這些發(fā)現(xiàn)提示我們TRA2B在這些核團中可能參與某些藥物成癮相關(guān)基因表達的調(diào)控。 為探索這種可能性,我們首先假設(shè)：如果TRA2B參與調(diào)控藥物成癮相關(guān)基因的表達,則TRA2B與受其調(diào)控的成癮相關(guān)基因所表達的蛋白在腦內(nèi)的空間分布應(yīng)該有一定的相關(guān)性。為驗證這一點,我們利用免疫熒光技術(shù)標記TRA2B蛋白,觀察它與一些成癮相關(guān)信號蛋白的共定位情況。我們觀察到TRA2B與一個藥物成癮信號因子——RGS4(Regulator of G-protein signaling4)在這些核團中有共分布現(xiàn)象。在大鼠前額葉皮層(PFC)、伏隔核(NAc)、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)、藍斑(LC)這些核團中,幾乎所有RGS4陽性細胞中都有TRA2B的表達。TRA2B與RGS4在空間分布上的共存現(xiàn)象提示了兩者之間可能存在的關(guān)聯(lián)。 根據(jù)已有的報道,TRA2B蛋白的主要功能特征是能夠結(jié)合到靶基因的前體mRNA上,與其他剪接因子構(gòu)成剪接小體,并幫助識別剪接位點。因此,如果TRA2B蛋白參與調(diào)控RGS4的表達,它很有可能會結(jié)合RGS4的前體mRNA,并與構(gòu)成剪接小體的其他蛋白有相互作用。通過分析TRA2B蛋白的免疫沉淀復(fù)合物,我們發(fā)現(xiàn)其中的確存在RGS4mRNA。同時,通過對TRA2B特異性免疫沉淀復(fù)合體的蛋白條帶的質(zhì)譜鑒定,我們發(fā)現(xiàn)了另外兩個SR蛋白家族成員——ASF/SF2和SRp30c。它們很可能與TRA2B蛋白一起存在于RGS4前體mRNA的剪接小體中,并對RGS4前體mRNA剪接起調(diào)控作用。 TRA2B與RGS4之間的相互結(jié)合作用提示了TRA2B對RGS4可能有調(diào)控作用。為了驗證這個可能性,接著我們又從細胞水平上研究TRA2B對RGS4的表達是否有調(diào)控作用。利用細胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)和RT-PCR、Western blot分析,我們發(fā)現(xiàn)TRA2B過量表達使細胞內(nèi)源性RGS4mRNA和蛋白水平都升高；而TRA2B表達抑制使RGS4mRNA和蛋白水平都顯著降低。而且TRA2B對于RGS4水平的影響還具有濃度依賴性。說明TRA2B的確能夠調(diào)控RGS4的表達。 此外,我們還深入研究了TRA2B蛋白有哪些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是可影響其對RGS4表達的調(diào)控功能。鑒于RS結(jié)構(gòu)域(Argnine/Serine-rich domain)決定了SR蛋白的核內(nèi)分布,而SR蛋白的核內(nèi)分布情況又與其功能息息相關(guān),因此我們首先通過缺失突變分析觀察了TRA2B蛋白的RS1結(jié)構(gòu)域及其突變體對其核內(nèi)分布的影響。結(jié)果顯示,TRA2B蛋白在核內(nèi)speckles的定位依賴于RS1結(jié)構(gòu)域而非RS2結(jié)構(gòu)域,說明兩個RS結(jié)構(gòu)域存在差異。此外,在RS1結(jié)構(gòu)域上,我們發(fā)現(xiàn)了多個能夠引導(dǎo)核內(nèi)speckle定位的由SR重復(fù)序列構(gòu)成的特殊信號,主要集中在56-68aa、79-89aa、89-99aa這幾個區(qū)段中。這些信號互相冗余,但是多個同時存在能使定位更加嚴格。 根據(jù)文獻報道,成癮藥物能夠影響相關(guān)核團中RGS4的表達水平。我們以上的結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRA2B在藥物成癮相關(guān)核團高表達并與RGS4共定位,并且TRA2B能夠結(jié)合RGS4mRNA并調(diào)控其表達水平,即TRA2B表達增高可增加RGS4的表達,反之,使之下降。因此,我們推測：如果TRA2B參與或介導(dǎo)了成癮藥物刺激引起的RGS4表達變化,那么在成癮情況下,成癮相關(guān)核團中的TRA2B和RGS4的表達水平變化也有類似的相關(guān)性。為了驗證這一推測,我們研究了成癮藥物——嗎啡刺激對TRA2B的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與注射生理鹽水的對照組相比,急性嗎啡刺激使大鼠藍斑區(qū)中TRA2B和RGS4蛋白含量降低,而慢性嗎啡刺激使大鼠藍斑區(qū)TRA2B和RGS4蛋白含量升高,阿片受體拮抗劑納洛酮可以抑制由嗎啡刺激引起的TRA2B和RGS4蛋白表達量的變化。這種變化的一致性提示TRA2B很有可能作為調(diào)控RGS4表達的上游基因參與成癮藥物刺激引起的RGS4蛋白水平變化,即通過調(diào)控RGS4表達而參與藥物成癮過程。 綜上所述,我們的工作圍繞著TRA2B調(diào)控藥物成癮相關(guān)因子RGS4的表達及其機制這一方向,進行了一些研究,發(fā)現(xiàn)了在藥物成癮相關(guān)核團中TRA2B和RGS4蛋白的共分布,在細胞模型中證明了TRA2B對RGS4的調(diào)控作用,并從TRA2B蛋白結(jié)構(gòu)方面研究了此種調(diào)控作用的機制。此外,這種細胞模型中觀察到的TRA2B對RGS4的調(diào)控作用所呈現(xiàn)的TRA2B和RGS4蛋白變化的相關(guān)性也存在著于成癮藥物刺激下的大鼠腦內(nèi)的成癮相關(guān)核團中。這些結(jié)果提示,作為一個在大腦中具有復(fù)雜功能的剪接調(diào)節(jié)因子,TRA2B很有可能通過調(diào)節(jié)藥物成癮相關(guān)因子RGS4基因的表達,參與到藥物成癮信號通路中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R3411

【共引文獻】

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