本文選題：丙型肝炎病毒　切入點：準種　出處：《昆明理工大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)為單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科,肝炎病毒屬,基因組全長約9.6kb。HCV在復制過程中,由于RNA依賴的RNA聚合酶缺乏校對功能,導致HCV高度變異。病毒在宿主體內存在的多種變異株(同源性95%)稱為準種。感染者體內存在的HCV準種反映在特定環(huán)境下以病毒復制、變異為基礎的突變株競爭性選擇的結果。準種的復雜情況與疾病進展、病程轉歸密切相關。病毒CTL抗原表位編碼基因發(fā)生變異產生的HCV準種,是病毒逃避宿主免疫監(jiān)控及藥物治療不反應的主要原因。 本研究首先根據(jù)HCV病毒載量等臨床指標,從50例候選者中篩選出16名HCV單獨感染者,經(jīng)5NCR區(qū)和NS5B區(qū)基因擴增及核酸序列分析,確定研究入選者感染HCV為4種基因型/亞型,分別為1b、3a、3b和6n,以1b(41.25%)和3b(36.75%)型為主。16名入選者均接受不同程度的藥物治療,經(jīng)長期(1.5年)病程跟蹤和臨床指標檢測發(fā)現(xiàn),8例入選者繼續(xù)維持慢性感染,另外8例病程轉歸,病毒RNA檢測為陰性。進而建立了E2區(qū)和NS5A區(qū)準種檢測方法-—多克隆測序分析法,以準種Neighbor-joining進化樹、標準化熵值、平均遺傳距離和dN/dS值等指標評價準種特性與變化情況。研究發(fā)現(xiàn),慢性感染者和治療病程轉歸者在入選初期,體內E2區(qū)準種平均遺傳距離波動分別為0.0097～0.0625和0.0037～0.0269,熵值波動分別為0.9063～0.9786和0.5769～0.8849；NS5A區(qū)準種平均遺傳距離波動分別為0.0050～0.0113和0.0022～0.0095,熵值波動分別在0.8847～0.9734和0.5187～0.8007。兩個區(qū)段HCV準種的平均遺傳距離和熵值,慢性感染者均大于治療病程轉歸者,表明HCV準種異質性程度越低的患者,更易于產生治療應答。對入選初期E2區(qū)和NS5A區(qū)準種dN/dS比值分析發(fā)現(xiàn),所有慢性感染者和6例病程轉歸者準種dN/dS比值都小于1,其體內準種變化主要由遺傳漂變引起。在病程轉歸者中,有2例患者dN/dS比值大于1,其準種變異是由達爾文進化壓力造成的。 進而,研究對入選者病程跟蹤,多個時間點采集的樣本,使用BEAST軟件估算患者體內HCV準種的起源時間和進化速率,構建準種群體數(shù)量變化的BSP圖,并對HCVE2區(qū)準種變化指標(多樣性和復雜性)與臨床指標(ALT值和AST值)相關性進行分析。發(fā)現(xiàn)8名慢性感染者隨著病程進展,E2區(qū)和NS5A區(qū)準種存在漸變和徹變兩種進化模式,這兩個基因區(qū)段準種變異呈現(xiàn)出協(xié)同進化的特點,即在同一個病人體內E2區(qū)和NS5A區(qū)段進化模式相同。治療病程轉歸者HCV準種進化速率(5.84×10-3 sub/site/month)明顯高于持續(xù)感染者(0.61×10-3～1.31×10-3sub/site/month)。HCV E2區(qū)準種的多樣性和復雜性與血清ALT、AST值之間無顯著相關性(p0.05)。 最后,研究采用Elispot方法對一例慢性感染者(KM10)病程進展過程中,不同時間采集的PBMC中效應性CTL數(shù)量進行了測定。經(jīng)HCV主要準種氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),該慢性感染者在入選觀察初期(T1期)病毒E2區(qū)CTL抗原表位(LLFTPGSKQNV)隨著病程進展(T4期)1年內發(fā)生了較大變化(SFFTSGPKQNI),利用合成的T1期主要準種抗原多肽(NH2-SLLFTPGSKQNVQ-COOH),分別刺激T1和T4期采集的PBMC細胞,發(fā)現(xiàn)此抗原多肽的效應性CTL在觀察初期(T1期)為307個,病程后期(T4期)只有21個,由于抗原表位編碼基因變異,CTL明顯不能免疫識別。 本研究對經(jīng)過治療的HCV單獨感染者進行隨訪研究,使用多克隆測序法分析HCV準種變異規(guī)律,并建立了Elispot方法分析HCV免疫逃逸,初步分析了CTL抗原表位變異的免疫逃逸能力及其對病程進展的影響,為丙型肝炎慢性化致病機制及疫苗研制等方面的研究提供直接依據(jù)。
[Abstract]:Hepatitis C virus (Hepatitis C, virus, HCV) is a single stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family, hepatitis virus, genome 9.6kb.HCV during replication, the RNA dependent RNA polymerase lacks proofreading function, resulting in HCV height variation. Different variants of the virus in the host body (95% homology) called quasispecies. Infection in the presence of HCV quasispecies is reflected in the specific environment for virus replication, mutation based mutant competitive selection results. With the development of complex quasi disease species, disease outcome closely related. CTL virus epitope encoding gene mutation of HCV quasispecies. The main reason is the virus to escape the host immune response is not monitoring and treatment.
Firstly, according to the HCV virus load and other clinical indicators, 50 cases from the candidates identified 16 patients infected with HCV alone, by the analysis of 5NCR and NS5B region gene amplification and DNA sequencing, identified as 4 genotypes / subtypes of HCV infection were enrolled in this study, respectively 1b, 3a, 3b and 6N. 1B (41.25%) and 3b (36.75%) type.16 patients received drug treatment in different degree, the long-term (1.5 years) to detect disease tracking and clinical indicators, 8 patients were maintained in 8 cases of chronic infection, the outcome of the diseases, viral RNA detection was negative. Then set up E2 and NS5A area quasispecies detection method of multiple cloning and sequencing analysis, the phylogenetic tree of Neighbor-joining quasispecies, standard entropy, average genetic distance and the dN/dS value evaluation of quasispecies characteristics and changes. The study found that the outcome of chronic infection and treatment duration in selected early in E2 area The average genetic distance of volatility was 0.0097 ~ 0.0625 and 0.0037 ~ 0.0269, the entropy volatility was 0.9063 ~ 0.9786 and 0.5769 ~ 0.8849; the average genetic distance of NS5A quasispecies fluctuations were 0.0050 ~ 0.0113 and 0.0022 ~ 0.0095, respectively in 0.8847 the average genetic entropy fluctuation of ~ 0.9734 and 0.5187 ~ two 0.8007. section HCV quasispecies the distance and entropy for chronic infection were higher than the treatment outcome of the diseases, showed that the HCV quasispecies heterogeneity is lower in patients are more prone to the response to treatment. The selected initial E2 and NS5A area quasispecies dN/dS ratio analysis showed that the outcome of all chronic infection and 6 cases of course of disease is less than the ratio of dN/dS quasispecies 1, the body is mainly composed of quasispecies changes caused by genetic drift. In the course of the disease outcome in 2 patients with dN/dS ratio greater than 1, the quasispecies variation is caused by Darwin's evolutionary pressure.
Then, the research on the selected course tracking, multiple time samples, the estimated HCV in the patients with quasi origin time and the evolution rate for the use of BEAST software, construction of quasispecies changes in the number of BSP, and a change of index of HCVE2 region (diversity and complexity) and clinical parameters (ALT value and AST) correlation analysis. The discovery of 8 chronic infection with the progression of the disease, which are gradual and fundamentally changed the two patterns of evolution of E2 and NS5A, the two gene quasispecies variation showed the characteristics of co evolution, i.e. in the same patient E2 and NS5A section of the same evolutionary pattern the clinical course of HCV treatment. Quasispecies evolution rate (5.84 x 10-3 sub/site/month) was significantly higher than that of infection (0.61 * 10-3 ~ 1.31 * 10-3sub/site/month).HCV E2 quasispecies complexity and diversity, and serum ALT, no significant correlation between AST values (p0.0 5).
Finally, Elispot method was used on a case of chronic infection (KM10) course, the number of effector CTL PBMC collected in different time were determined by HCV. The main quasispecies amino acid sequence analysis showed that the chronic infection in selected initial observation (T1) virus E2 CTL epitope (LLFTPGSKQNV) with disease progression (T4) changed greatly within 1 years (SFFTSGPKQNI), using T1 synthesis mainly quasispecies antigenic peptides (NH2-SLLFTPGSKQNVQ-COOH), T1 and T4 were used to stimulate acquisition of PBMC cells, found the antigen peptide effector CTL in the observation of early (T1) 307 a later stage (stage T4), only 21, due to the epitope encoding gene mutation, CTL was not immune recognition.
The research on the follow-up study after treatment of HCV infection alone, analysis of HCV quasispecies variation using multi clone sequencing method, and Elispot method was established for analysis of HCV immune escape, a preliminary analysis of CTL epitope variation in immune escape ability and its influence on disease progression, provide direct basis for the study of pathogenic mechanism of hepatitis C hepatitis B vaccine development and other aspects.

【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

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