本文選題：根際促生菌　切入點：原核病原菌　出處：《暨南大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前廣泛應(yīng)用的抗生素大部分是由各種放線菌(Actinomycete)所產(chǎn)生,其中的很多種類在醫(yī)藥行業(yè)中具有重要的一席之地。放線菌在微生態(tài)制劑中也有廣泛的應(yīng)用,即利用正常微生物或促進微生物生長的物質(zhì)制成微生物制劑從而發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)。但生態(tài)系統(tǒng)中各種生物之間存在著十分復(fù)雜的關(guān)系,因此菌株在繁殖過程中會低頻率地發(fā)生一些雜交和突變,有可能導(dǎo)致其形態(tài)性狀和生理作用效應(yīng)的改變,也需要隨時進行檢測以確保微生態(tài)制劑的安全性和有效性。此外,微生態(tài)制劑在菌種選擇和配搭時,需要進行一系列的交叉接種試驗,研究植物根際的微生物即植物與微生物,微生物與微生物以及土壤與微生物之間的相互作用,為科學(xué)合理的選擇能夠共生、促生的菌株提供參考。 基于上述分析,本實驗從幾種復(fù)合微生態(tài)制劑中分離出一系列不同的放線菌菌株,與實驗室保存的菌株自生固氮菌GNW (Acinetobacter calcoaceticus)和解磷菌HP2(Azotobacter chroococcum)混合接種培養(yǎng),檢測是否因基因雜交、突變等原因而產(chǎn)生具有抑菌作用的菌株。結(jié)果分離出一株具有抑菌作用的放線菌菌株—GNF1,根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和基于16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,鑒定其屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的一個菌株——細黃鏈霉菌(Streptonmyces microflavus), GNF1菌株的發(fā)酵液提取物中存在具有抑菌作用的活性成分,與植物根際促生菌GNW, HP2以及某些原核病原微生物,如大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和變形桿菌{Proteus vulgaris)等共培養(yǎng)時能不同程度地抑制它們的生長；其發(fā)酵液粗提物抗真菌活性較低,能較低水平的抑制真菌,如白地霉(Geotrichum candidum)、白色念珠菌(C.albicans)、克柔假絲酵母(C. krusei)和紅色毛癬霉(T richophy ton rubrum); MTT結(jié)果顯示GNF1菌株的發(fā)酵液提取物具有抗腫瘤活性；抗病毒試驗結(jié)果為陰性,初步推測其不具有抗病毒活性。 目的： 通過對復(fù)合微生態(tài)制劑中的菌種與土壤固有微生物之間的相互作用的研究,檢測是否存在具有抑菌作用的放線菌菌株,通過形態(tài)學(xué)特征生理生化特征和16SrRNA序列對比,鑒定種屬；進而檢驗其對一些病原微生物的抗菌作用、抗病毒和抗腫瘤作用,并對其抑菌作用的機制進行初步的研究。 研究方法： 1.通過選擇性培養(yǎng)基,首先根據(jù)形態(tài)學(xué)差異從市售的微生態(tài)制劑中初步分離一系列的不同的放線菌受試菌株； 2.將分離的放線菌菌株與本實驗室保存的兩種菌株自生固氮菌GNW和解磷菌HP2混合接種培養(yǎng),通過初步篩選以及管碟法的驗證試驗,檢測是否存在具有抑菌作用的目的菌株； 3.根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,對目的菌株進行鑒定； 4.發(fā)酵液抗菌活性測定法檢測抗菌作用(抗細菌、抗真菌)、抗病毒抗腫瘤作用。 5.采用MTT法檢測發(fā)酵液提取物抗腫瘤活性。 實驗結(jié)果： 1.經(jīng)過選擇性培養(yǎng)基的初步分離鑒定,共得到6株放線菌。初步篩選后,標記為GNF1的菌株與GNW和HP2共培養(yǎng)時,后兩者受到抑制作用具有顯著性差異；其抑菌物質(zhì)存在與GNF1的發(fā)酵液中,管碟法進一步驗證了其抑菌作用。 2.菌株GNF1具有典型的鏈霉菌屬(Streptomyces)的特征：基內(nèi)菌絲多分枝,不斷裂,氣生菌絲豐富,孢子鏈直且長,偶有波曲,孢子呈柱狀。菌株在多數(shù)培養(yǎng)基上生長良好,氣高氏淀粉瓊脂上氣生菌絲體白至杏仁黃色,成熟時粉紅發(fā)紫。 3.實驗證實菌株GNF1的生長溫度范圍為10～40℃,最適溫度為28℃。生長pH范圍為6.0-8.5,最適pH 7.0。淀粉水解、明膠液化、硫化氫產(chǎn)生陰性；不能水解Tween20和酪素(Casein);黑色素產(chǎn)生、牛奶胨化、纖維素水解和硝酸鹽還原陰性。菌株GNF1能利用多種物質(zhì)做碳源和氮源(表3)。菌株GNF1全細胞水解產(chǎn)物中含甘氨酸、天門冬氨酸等氨基酸,含葡萄糖、半乳糖、木糖和核糖等糖類。上述這些結(jié)果與鏈霉菌屬特征相符。 4.選用菌株基因組DNA作為PCR的擴增模板,采用細菌16S rRNA通用引物進行16S rRNA的擴增。成功擴增出菌株的16SrRNA。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測正確與否,送大連寶生物公司進行測序。 5.根據(jù)16SrRNA序列來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),GNF1菌株與細黃鏈霉菌(Streptonmyces microflavus)的16S rRNA序列僅相差6個堿基,同源性達99.6%。結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化特征,初步鑒定將GNF1菌株暫定為Streptonmyces microflavus。6.GNF1的發(fā)酵液提取物能抑制大腸桿菌(Escherichia coli).金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureaus)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)和變形桿菌(Proteus vulgaris)等革蘭氏陰性的病原微生物,其抑菌效果接近鏈霉素的水平；其發(fā)酵液粗提物抗真菌活性較低,能較低水平的抑制真菌,如白地霉(Geotrichum candidum)、白色念珠菌(C.albicans)^克柔假絲酵母(C. krusei)和紅色毛癬霉(T richophy ton rubrum);抗病毒試驗結(jié)果為陰性,初步推測其不具有抗病毒活性。 7、MTT實驗結(jié)果顯示,GNF1菌株發(fā)酵液提取物能夠抑制肝癌細胞HepG2的活性,而對正常肝細胞L-02無明顯抑制作用,推測GNF1菌株發(fā)酵液提取物可能含有抗腫瘤的活性成分。 結(jié)論： 1.成功分離出一株具有抑菌作用的菌株,該菌株為細黃鏈霉菌的一突變株,其活性物質(zhì)對多種病原微生物具有較為廣泛的抑菌作用效應(yīng)； 2.鑒于GNF1發(fā)酵液粗提物的抑菌活性和抗腫瘤作用,有待深一步研究其作用機制和開發(fā)相關(guān)抗菌微生態(tài)制劑或者是抗腫瘤藥物的價值； 3.一些微生態(tài)制劑和微生態(tài)有機肥應(yīng)建立相關(guān)指標；并定期檢測其中的菌株是否有突變等情況,以期能保證產(chǎn)品的安全性和有效性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R379

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蘇濤;馬宗琪;司美茹;;魯西南地區(qū)土壤放線菌的生態(tài)分布[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年02期

2 王威;楊華;;大腸桿菌感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化實驗[J];畢節(jié)學(xué)院學(xué)報;2009年04期

3 毛忠貴;陳建新;張建華;;發(fā)酵工業(yè)與清潔生產(chǎn)[J];發(fā)酵科技通訊;1999年01期

4 王慧玲;葉新;趙以軍;程凱;;一株高效溶藻放線菌的分子生物學(xué)鑒定[J];環(huán)境科學(xué)與技術(shù);2009年06期

5 逄蕾;肖洪浪;路建龍;周茂先;;干旱半干旱地區(qū)砂田交界層土壤微生物區(qū)系研究[J];干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究;2011年01期

6 張炳火;方亮;李漢全;過七根;;微生物資源研究開發(fā)進展[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2006年05期

7 滕海波;唐學(xué)璽;肖慧;俞勇;李會榮;;北極黃河站植物根際土壤放線菌分離培養(yǎng)及其鑒定[J];極地研究;2009年01期

8 饒正華,林啟美,孫焱鑫,姚軍,刑禮軍,張有山;解鉀菌與解磷菌及固氮菌的相互作用[J];生態(tài)學(xué)雜志;2002年02期

9 譚之磊;王來福;肖湘政;楊則媛;;細黃鏈霉菌005發(fā)酵條件優(yōu)化及在玉米上的應(yīng)用[J];中國土壤與肥料;2008年02期

10 常慧萍;祝凌云;姚麗娟;于士軍;唐欣昀;;小麥根際固氮菌、解磷菌及解鉀菌的互作效應(yīng)[J];中國土壤與肥料;2008年04期

，

本文編號：1636675