發(fā)布時間：2018-03-19 23:26

  本文選題：DNA感受器　切入點(diǎn)：AIM2炎性體通路　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的] 1)在整體水平觀察小鼠MCMV感染后脾巨噬細(xì)胞內(nèi)AIM2炎性體各組分蛋白及其下游促炎因子IL-1β和IL-18的時序性表達(dá)變化,證實AIM2對MCMV DNA的識別并探討其炎性體通路在抗MCMV天然免疫與獲得性免疫機(jī)制中的作用； 2)在整體水平觀察MCMV播散性感染急性期脾Th17細(xì)胞的分化及其細(xì)胞因子IL-17A在不同臟器內(nèi)的表達(dá)變化,分析Th17細(xì)胞和IL-17A表達(dá)與MCMV載量及脾和唾液腺病理改變的相關(guān)性,探討Th17細(xì)胞在急性播散性MCMV感染致病機(jī)制中的作用。 [方法] 1)建立動物模型：45只4.5周齡BALB/c小鼠,腹腔接種(5×103)PFU MCMV Smith株,建立播散性感染模型,另45只小鼠模擬感染做為對照。于病毒接種后3 d、7 d、14 d、28d(急性期末)和45 d,收集小鼠靜脈血和無菌分離脾、唾液腺、肝和肺組織。為獲取足夠的脾巨噬細(xì)胞和血清樣本量,各組每個時間點(diǎn)隨機(jī)抽取3只小鼠為1小組,其靜脈血予以混合,脾臟各取2/3加以混合富集巨噬細(xì)胞,其余組織樣本隨機(jī)抽取3份,故每個時間點(diǎn)的樣本數(shù)為3； 2)AIM2炎性體通路蛋白表達(dá)：分離小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞,提取蛋白,用Western blot法檢測AIM2炎性體通路蛋白包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和(?)caspase-1的表達(dá)強(qiáng)度,設(shè)GAPDH為內(nèi)參蛋白,以各目的蛋白與GAPDH蛋白積分光密度比值(K值)進(jìn)行半定量分析； 3)血清IL-1p和IL-18水平：用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中AIM2炎性體通路下游細(xì)胞因子IL-1β和IL-18水平的變化； 4)優(yōu)化Th17細(xì)胞分化誘導(dǎo)方案：分離3只正常小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞；分別應(yīng)用無刺激、滅活MCMV、PMA/Ionomycin、滅活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法；在脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)刺激不同時間后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(?)CD3+CD4+IL-17A+細(xì)胞比率；并用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-17A蛋白濃度,觀察分析不同方法誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的效應(yīng),選擇最佳的分化誘導(dǎo)方法； 5)脾Th17細(xì)胞比率和病毒特異性IL-17A表達(dá)水平：取急性期階段即感染后3d、7d、14d和28d的脾組織,分離脾臟淋巴細(xì)胞。采用滅活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化,用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+IL-17A+細(xì)胞比率。用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-17A濃度時,設(shè)立單獨(dú)PMA/Ionomycin刺激組作為基礎(chǔ)刺激對照,計算滅活MCMV/PMA/Ionomycin刺激和單獨(dú)PMA/Ionomycin刺激脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A濃度之差值來評估病毒特異性IL-17A表達(dá)水平。對比分析兩組之間的差異; 6)不同臟器組織中IL-17A蛋白表達(dá)：用免疫組織化學(xué)染色法檢測急性期試驗小鼠脾、唾液腺、肝、肺組織中IL-17A蛋白的表達(dá)分布情況,對比分析不同臟器組織的局部免疫特征； 7)脾和唾液腺病理變化：取脾和唾液腺組織切片行HE染色,半定量評估急性期試驗小鼠脾和唾液腺組織的病理變化； 8) MCMV病毒載量：用標(biāo)準(zhǔn)空斑試驗檢測急性期各臟器組織內(nèi)感染性病毒滴度； 9)相關(guān)性分析：對脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A和組織中IL-17A蛋白表達(dá)水平與脾和唾液腺組織病理損傷程度及病毒載量進(jìn)行相關(guān)性分析。 [結(jié)果] 1) AIM2炎性體通路蛋白表達(dá)：MCMV感染后的脾巨噬細(xì)胞提取蛋白中,AIM2炎性體通路各組分包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)一致性變化,均在感染后3d(感染早期)顯著升高達(dá)峰值,與模擬感染對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,K值分別為(1.120±0.243)vs(0.230±0.046)；(1.318±0.333)vs (0.248±0.090)；(2.049±0.401)vs(0.390士0.120)；(1.483±0.420)vs(0.176±0.045),均 P0.01；其后表達(dá)均下降,與對照組水平相當(dāng)； 2)血清IL-1p和IL-18水平：MCMV感染組血清IL-1β和IL-18濃度于感染后3d明顯高于模擬感染對照組,IL-1β濃度為(111.050±28.500)vs(55.858±2.983)pg/ml,P0.05；IL-18濃度達(dá)(99.911±2.222)vs(57.206±6.228)pg/ml,P0.01； 3)優(yōu)化Th17細(xì)胞分化誘導(dǎo)方法：無刺激組和滅活MCMV刺激組均不能有效誘導(dǎo)Th17細(xì)胞表達(dá)。與應(yīng)用相同方法培養(yǎng)刺激1 d+6 h組及應(yīng)用PMA/Ionomycin培養(yǎng)刺激6h組相比,滅活MCMV+PMA/Ionomycin培養(yǎng)刺激6h組能夠有效誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化[Th17細(xì)胞比率分別為(0.163±0.035)vs(0.083±0.032)%,P0.05；(0.163±0.035)vs(0.033±0.015)%,P0.01]；同時,脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A濃度也明顯升高[分別為(67.246±4.578)vs(45.317±8.793)pg/ml,P0.05；(67.246±4.578)vs(24.474±5.134)pg/ml,P0.01]； 4)脾Th17細(xì)胞比率和病毒特異性IL-17A表達(dá)水平：MCMV感染后3d,7d,14d,28d,小鼠脾淋巴細(xì)胞體外經(jīng)優(yōu)化方法誘導(dǎo)分化,Th17細(xì)胞比率均高于模擬感染對照組[分別為(0.67±0.13)vs(0.22±0.02)%,P=0.004；(0.82±0.02)vs(0.18±0.06)%,P=0.004；(1.14±0.09)vS(0.19±0.04)%,P=0.000；(0.47±0.11)vs(0.20±0.06)%,P=0.017]。MCMV感染組脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A蛋白濃度在感染后3、7 d雖有升高,但與模擬感染對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；而感染后14d達(dá)峰值,明顯高于對照組[(81.98±12.37)vs(44.96±8.44)pg/ml,P0.01]；至感染后28 d雖有下降,但仍高于對照組[(57.58±8.14)vs(35.10±10.41)pg/ml,P0.05]； 5)不同臟器組織中IL-17A蛋白表達(dá)：MCMV感染鼠的肝、肺組織中僅于感染后3d可見少量IL-17A+細(xì)胞；脾和唾液腺組織中可見明顯增多的IL-17A+細(xì)胞,并于感染后14d達(dá)峰值,且部分唾液腺分泌管上皮細(xì)胞也表達(dá)IL-17A； 6)脾和唾液腺病理變化：MCMV感染后14d脾組織病理損傷程度最重：白髓結(jié)構(gòu)明顯破壞,可見大量吞噬細(xì)胞、出血壞死及纖維條索增生；MCMV感染后14d唾液腺組織病理損傷程度也最嚴(yán)重：出現(xiàn)大量炎性浸潤灶,組織結(jié)構(gòu)明顯破壞； 7) MCMV病毒滴度：肝和脾組織病毒滴度于感染后3d升高,其后迅速下降,14d檢測不到；肺組織病毒滴度低于檢測低限,而唾液腺組織病毒滴度呈逐漸增高趨勢,于感染后14d達(dá)峰值； 8)相關(guān)性分析：脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A蛋白濃度與唾液腺組織病毒滴度呈正相關(guān)(r=0.74,P0.01)；脾和唾液腺組織病理損傷越重,脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A蛋白濃度越高(r=0.78,P0.01)；唾液腺組織內(nèi)的IL-17A蛋白表達(dá)與MCMV滴度變化呈正相關(guān)(r=0.63,P0.05),并與脾和唾液腺組織病理損傷程度也呈正相關(guān)(r=0.68,P0.01)。 [結(jié)論] 1)在MCMV感染早期,小鼠脾巨噬細(xì)胞AIM2感受器能夠識別胞內(nèi)MCMV DNA;AIM2炎性體參與MCMV感染早期的抗病毒天然免疫應(yīng)答；同時,通過其下游細(xì)胞因子IL-1β和IL-18在啟動獲得性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。 2) MCMV感染急性期IL-17A蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯組織差異性分布,其在唾液腺中高表達(dá)的局部免疫特征可能是MCMV(?)能夠在唾液腺中長期持續(xù)復(fù)制的關(guān)鍵免疫因素之一；Th17細(xì)胞可能通過IL-17A參與MCMV持續(xù)性感染及組織免疫病理損傷機(jī)制。
[Abstract]:[Objective]
1) to observe the timing of the expression changes of MCMV infected mice after splenic macrophages within the AIM2 inflammasome component protein and its downstream proinflammatory cytokine of IL-1 and IL-18 in the overall level, confirmed the identification of MCMV DNA AIM2 and to explore its anti MCMV inflammasome pathway in innate and acquired immune system in effect;
2) to observe the expression changes of differentiation and cytokine IL-17A Th17 cells of spleen MCMV acute disseminated infection in different organs in the overall level, analysis of Th17 cells and the correlation between the expression of IL-17A and MCMV load and the spleen and salivary gland pathological changes, to explore Th17 cells in acute disseminated MCMV infection pathogenic effect.
[method]
1) the establishment of animal model: 45 4.5 week old BALB/c mice were inoculated intraperitoneally (5 * 103) PFU MCMV Smith strain, a disseminated infection model, the other 45 mice simulated infection as control. After virus inoculation in 3 D, 7 d, 14 d, 28d (acute final) and 45 D. Venous blood were collected and sterile isolated salivary gland, spleen, liver and lung tissues. In order to obtain the splenic macrophages and serum samples in sufficient quantities, each time point of 3 mice were randomly selected into 1 groups, the venous blood to be mixed, the mixture of 2/3 enriched spleen macrophages, the remaining tissue samples of 3 random samples. The number of samples in each time point is 3;
2)AIM2鐐庢，

本文編號：1636522