本文選題：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：分化　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率越來(lái)越高，早老性癡呆、帕金森等常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病越來(lái)越受到社會(huì)和全世界的廣泛關(guān)注，以干細(xì)胞為代表的神經(jīng)再生醫(yī)學(xué)的崛起為神經(jīng)系統(tǒng)病變的治療提供了新的思路和平臺(tái)。臍帶中的間充質(zhì)干細(xì)胞是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。其與成體干細(xì)胞相比，具有更強(qiáng)的增殖分化能力。在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化成為多種組織細(xì)胞，是目前用于干細(xì)胞治療的干細(xì)胞來(lái)源之一。而干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化更是研究的重點(diǎn)。本試驗(yàn)研究大鼠大腦皮層勻漿對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)誘導(dǎo)分化的影響。從形態(tài)學(xué)上觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否具有神經(jīng)元樣特征，用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否有神經(jīng)元特有的功能酶烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)和GABA能神經(jīng)元的標(biāo)志物谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase, GAD)表達(dá)。GAD是專一的γ-氨基丁酸合成酶，在其催化下，谷氨酸(glutamate, Glu)脫羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)。GAD可以看作是GABA能神經(jīng)元的標(biāo)志物。應(yīng)用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞中γ-氨基丁酸(GABA)的水平，探討微環(huán)境對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制。這將為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供更充足的理論依據(jù)。 方法： 1大鼠大腦皮層勻漿的制備 取10雄性Sprague Dawley (SD)大鼠，體重200~230g，將其分別斷頭處理后，取出大腦皮層置于冰上，稱其濕重。然后在冰上勻漿(150mg/mL DMEM/F12)，勻漿后在室溫下以3000rmin-1的轉(zhuǎn)速離心15min，取離心后的上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，作為誘導(dǎo)培養(yǎng)液。 2hUC-MSCs的正常培養(yǎng)與用大鼠大腦皮層勻漿誘導(dǎo)后的形態(tài)觀察 本實(shí)驗(yàn)中所用的干細(xì)胞為4-6代，且經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定為hUC-MSCs。用胰蛋白酶消化干細(xì)胞，將其制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為5×10~4個(gè)/mL，每孔0.5mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孔內(nèi)預(yù)先鋪有經(jīng)鼠尾膠原處理的蓋玻片，并將其置于37℃，5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后，待細(xì)胞貼壁伸展后加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液，并以正常培養(yǎng)的hUC-MSCs作對(duì)照，密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 3使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色 按SABC免疫細(xì)胞化學(xué)說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。鑒定經(jīng)大鼠大腦皮層勻漿誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否表達(dá)NSE和GAD-67，推測(cè)其是否具有GABA能神經(jīng)元的特征。 4細(xì)胞樣本的收集與處理 將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，棄去培養(yǎng)液，將貼壁細(xì)胞用細(xì)胞刮刀收集，將其漂洗干凈，離心后收集細(xì)胞沉淀，使用細(xì)胞超聲碎裂儀使細(xì)胞裂解，離心收集上清，冷凍保存待測(cè)。 5用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定細(xì)胞樣品中的GABA 本實(shí)驗(yàn)分析柱采用ZIC-HILIC柱(3.5μm，2.1mm×50mm，100APEEK HPLC Column德國(guó)默克時(shí)光公司)，流動(dòng)相為乙腈：水(含0.5%甲酸)=8:2，流速200μL·min-1，正離子ESI源檢測(cè)，Spray Voltage4.0kV，Sheath Gas Pressure(N2)45psi，選擇離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)定量分析的離子分別為m/z104→m/z87(GABA)、m/z285→m/z200(morphine)。碰撞能量為10V(GABA)和24V(morphine)，掃描時(shí)間scan time600ms。 本實(shí)驗(yàn)建立了一種靈敏、準(zhǔn)確和特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法，可以滿足待測(cè)細(xì)胞中GABA的測(cè)定需要。 結(jié)果： 1正常培養(yǎng)組hUC-MSCs的形態(tài)學(xué)特征 顯微鏡下觀察hUC-MSCs正常培養(yǎng)組，大部分細(xì)胞呈梭型、多角形，細(xì)胞折光性好，核仁明顯。少量細(xì)胞胞體大而扁平，立體感不強(qiáng)。 2大腦皮層勻漿誘導(dǎo)后hUC-MSCs的形態(tài)學(xué)變化 顯微鏡下觀察大鼠大腦皮層勻漿液誘導(dǎo)后，hUC-MSCs的分化狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化。加入勻漿液培養(yǎng)24h后，即可見(jiàn)大部分hUC-MSCs形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，表現(xiàn)為胞體收縮，變?yōu)閳A形，突起增多變長(zhǎng)，胞體亮度高，折光性變強(qiáng)；48h后，絕大部分細(xì)胞由圓形慢慢長(zhǎng)成梭形、多邊形和不規(guī)則形。大部分細(xì)胞的形態(tài)都已發(fā)生了變化，具有了神經(jīng)元樣細(xì)胞的特征；72h后，大部分細(xì)胞的形態(tài)再無(wú)明顯變化。 3誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的NSE和GAD-67表達(dá) 誘導(dǎo)hUC-MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化72h后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)NSE和GAD-67的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)的hUC-MSCs不表達(dá)NSE和GAD-67；大部分誘導(dǎo)后的細(xì)胞NSE和GAD-67表達(dá)陽(yáng)性。 4GABA測(cè)定方法學(xué)確證 本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)γ-氨基丁酸的方法。細(xì)胞樣品中的GABA在5ng~500ng·mL~(-1)范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低定量限(lower limit of quantization, LLOQ)為5ng·mL~(-1)。線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度實(shí)驗(yàn)顯示本方法適用于誘導(dǎo)后的干細(xì)胞中GABA的測(cè)定。正常培養(yǎng)的hUC-MSCs樣品GABA含量低于最低定量限，皮層組織誘導(dǎo)后的細(xì)胞樣品中GABA含量均可定量測(cè)定。 5大腦皮層勻漿誘導(dǎo)對(duì)hUC-MSCs分化后細(xì)胞內(nèi)GABA的水平的影響 正常培養(yǎng)的hUC-MSCs內(nèi)GABA的濃度均低于最低定量限。大鼠大腦皮層勻漿誘導(dǎo)0d組細(xì)胞內(nèi)GABA的含量為0ng；3d組細(xì)胞內(nèi)GABA的含量為(48.6±9.6) ng；5d組的含量為(59.4±4.9) ng。7d組的含量分別為(28.6±6.0) ng。與大鼠大腦皮層勻漿誘導(dǎo)3d組比較，誘導(dǎo)7d組細(xì)胞中GABA含量降低了51.8%(P0.05)，而5d組細(xì)胞中GABA水平則未見(jiàn)顯著性改變(P0.05)。 結(jié)論： 1hUC-MSCs經(jīng)大鼠大腦皮層勻漿誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，并且免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示其表達(dá)NSE和GAD-67。提示誘導(dǎo)后的細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)志物方面已具有部分GABA能神經(jīng)元的特征。 2經(jīng)大鼠大腦皮層微環(huán)境誘導(dǎo)后，hUC-MSCs分化的細(xì)胞內(nèi)GABA水平顯著升高，表明該細(xì)胞具有了合成GABA的能力，但其是否為典型的GABA能神經(jīng)元，仍需要進(jìn)一步研究證明。
[Abstract]:Objective: with the arrival of the aging society, the incidence of neurodegenerative diseases is more and more high, Alzheimer's disease, Parkinson and other common diseases of the nervous system are getting more and more attention of society and the whole world, as represented by the neural stem cells in regenerative medicine for nerve system disease treatment rise provides a new ideas and platform. The umbilical cord mesenchymal stem cells are a group of mesodermal self-renewal and multilineage differentiation potential of pluripotent stem cells. Compared with the adult stem cells, proliferation and differentiation ability. In particular the in vivo environment, umbilical cord mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into a variety of tissue, is currently used for stem cell therapy of stem cells and stem cells. One of the directional differentiation is the focus of the study. The experimental study on rat cerebral cortex homogenate of human umbilical cord mesenchymal Mesenchymal stem cells (human umbilical cord-mesenchymal stem cells, hUC-MSCs) differentiation. The morphological observation of whether the induced cells with neuronal characteristics, immunocytochemistry was used to identify the induced cells have functional enzyme enolization enzyme specific neurons (neuron-specific enolase, NSE) and markers of glutamic acid decarboxylase GABA neurons (glutamic acid decarboxylase, GAD.GAD) is a specific expression of gamma aminobutyric acid synthase, in the presence of glutamate (glutamate, Glu) decarboxylation of GABA (gamma -aminobutyric acid, GABA.GAD) can be regarded as a marker of GABA neurons. The neuron like cells by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry in gamma aminobutyric acid (GABA) level, to explore the influence of microenvironment on differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells and its mechanism. This will be the umbilical cord More sufficient theoretical basis is provided for the clinical application of mesenchymal stem cells.
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本文編號(hào)：1605969