發(fā)布時(shí)間：2018-03-10 10:49

  本文選題：去分化　切入點(diǎn)：分化后表皮細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景和目的 較大面積重度的全身燒創(chuàng)傷患者，通過(guò)皮膚移植等常規(guī)手術(shù)方法，幾乎無(wú)一避免會(huì)出現(xiàn)創(chuàng)面瘢痕愈合的結(jié)局。雖然表皮干細(xì)胞對(duì)于嚴(yán)重創(chuàng)面修復(fù)的組織工程學(xué)具有重要幫助，但重度全身燒傷患者殘存的正常皮膚很少，正常皮膚的表皮干細(xì)胞數(shù)量本身就很有限，只占正常表皮基底層的1%-10%，干細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)達(dá)不到修復(fù)上述創(chuàng)面的要求，顯然這會(huì)明顯限制干細(xì)胞組織工程技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用。是否有可以解決表皮干細(xì)胞短缺，獲得足量的表皮干細(xì)胞將其移植到創(chuàng)面，最終可能實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面的“完美修復(fù)”這樣的方法呢？ 去分化就是獲得大量成體干細(xì)胞的途徑之一，表皮細(xì)胞存在去分化現(xiàn)象。已分化成熟的終末分化表皮細(xì)胞通過(guò)去分化可以反向分成他們的父輩細(xì)胞，也就是說(shuō)，表皮細(xì)胞可以從“年老的”分化狀態(tài)返回到“年輕的”不完全分化、甚至具有表皮干細(xì)胞特征的幼稚狀態(tài)的過(guò)程。而這些去分化來(lái)源的“年輕”細(xì)胞可用于上述創(chuàng)面治療。我們?nèi)绾沃鲃?dòng)地將已分化細(xì)胞在體外為誘導(dǎo)成為分化程度較低形式的細(xì)胞，甚至分化程度更低的再生皮膚能力更強(qiáng)的表皮干細(xì)胞呢？ 答案是肯定的。有報(bào)道，某些特定因素可以誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化。因此，建立可靠而穩(wěn)定的去分化方法將從根本上解決上述疾病治療面臨的表皮干細(xì)胞數(shù)量短缺的嚴(yán)重問(wèn)題。去分化方法是一符合道德、倫理規(guī)范的替代方案，沒(méi)有遺傳不相容和組織排斥風(fēng)險(xiǎn)。 成熟細(xì)胞去分化時(shí)涉及幾條復(fù)雜的信號(hào)通路，如Wnt/β-連環(huán)蛋白、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和Janus激酶（JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)通路。但尚未有研究報(bào)告誘導(dǎo)分化表皮細(xì)胞退回到有再生能力不成熟狀態(tài)的通路。越來(lái)越多的證據(jù)表明，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于皮膚的正常發(fā)育十分必要，Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)器是參與維持皮膚祖細(xì)胞群的β-連環(huán)蛋白。研究亦表明，β-連環(huán)蛋白水平升高會(huì)導(dǎo)致表皮干細(xì)胞增生并誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛囊干細(xì)胞。 本研究第一部分是在前期表皮干細(xì)胞工作基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討并確立穩(wěn)定的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)體系，為深入去分化研究奠定基礎(chǔ)。第二部分特別針對(duì)性探討β-連環(huán)蛋白活化對(duì)于分化表皮細(xì)胞特性的影響。首先應(yīng)用氯化鋰（LiCl）和高度特異性GSK-3β抑制劑誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白表達(dá)，然后針對(duì)β-連環(huán)蛋白活化對(duì)于去分化細(xì)胞的形態(tài)、表型和生長(zhǎng)特性的影響進(jìn)行觀察，最后對(duì)比去分化細(xì)胞體外再生表皮的能力。 二、方法 新鮮人包皮片前期處理后，用中性蛋白水解酶分離得到表皮，制成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法移去已分化表皮細(xì)胞，光鏡和電鏡下觀察表皮干細(xì)胞的特點(diǎn)，并使用表皮干細(xì)胞標(biāo)記物鑒定。利用差速貼壁法從表皮片中分離出人體表皮細(xì)胞接種于6孔板并分為3組，即對(duì)照組（無(wú)處理組），LiCl處理組和GSK-3β抑制劑處理組。應(yīng)用LiCl和高度特異性GSK-3β抑制劑活化β-連環(huán)蛋白表達(dá)，針對(duì)β-連環(huán)蛋白活化對(duì)于去分化細(xì)胞的形態(tài)、表型和生長(zhǎng)特性的影響觀察，并對(duì)比細(xì)胞體外再生表皮的能力。 三、結(jié)果 差速貼壁法分離表皮得到的表皮干細(xì)胞具有干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，光鏡下細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，由小圓珠狀漸成方形的鋪路石狀。電鏡下核大，細(xì)胞器少，為典型非成熟細(xì)胞。2周后原代細(xì)胞鋪滿瓶底。用含生長(zhǎng)促進(jìn)因子的DMEM/F12培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞24h即可伸展貼壁和伸展，原代細(xì)胞3-4d即鋪滿瓶底。原代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞免疫組化顯示表皮干細(xì)胞的系列表面標(biāo)記物，不表達(dá)已分化表皮細(xì)胞的標(biāo)記物CK10。 3組細(xì)胞中，免疫印跡和光動(dòng)力學(xué)分析顯示β-連環(huán)蛋白在LiCl組和GSK-3β抑制劑組表皮細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)較未處理組顯著增高。培養(yǎng)3、6d時(shí)，倒置相差顯微鏡下見(jiàn)兩處理組細(xì)胞表現(xiàn)為表皮干細(xì)胞的典型變化。免疫組化分析表明兩處理組CK10表達(dá)的數(shù)量和比例均顯著下降，而表皮干細(xì)胞的標(biāo)記物CK19和β1整合素的表達(dá)加強(qiáng)。與對(duì)照組相比，Oct4和Nanog基因在去分化的處理組細(xì)胞中高4-6倍。3d時(shí)兩處理組已明顯的集落形成，而對(duì)照組生長(zhǎng)稀疏。流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的細(xì)胞周期數(shù)據(jù)表明兩處理組中有較多細(xì)胞處于增殖期，，且與對(duì)照組有顯著差異。持續(xù)傳代培養(yǎng)表明兩處理組有更強(qiáng)的遠(yuǎn)期增殖潛能。培養(yǎng)11d后，對(duì)照組未成表皮單層，但處理組和表皮干細(xì)胞組在真皮替代物表面再生了復(fù)層表皮。 四、結(jié)論 采用中性蛋白酶選擇性的水解真皮和表皮之間的細(xì)胞連接，再用差速貼壁法分離表皮干細(xì)胞是一種高效的表皮干細(xì)胞獲取方法。含10%FBS低糖DMEM/F12是可以保持表皮干細(xì)胞去分化狀態(tài)的良好培養(yǎng)基。 表皮細(xì)胞在分化后能夠因β-連環(huán)蛋白的表達(dá)增加而重新恢復(fù)表皮干細(xì)胞的特征。LiCl和GSK-3β抑制劑處理可引起分化后表皮細(xì)胞胞核中的β-連環(huán)蛋白表達(dá)增加。去分化細(xì)胞表皮能表現(xiàn)出干細(xì)胞的形態(tài)、表型和生長(zhǎng)特性。此外，去分化的細(xì)胞所再生的表皮與表皮干細(xì)胞所產(chǎn)生的類似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)控β-連環(huán)蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)高效的去分化過(guò)程可產(chǎn)生豐富的表皮干細(xì)胞。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路對(duì)皮膚創(chuàng)面修復(fù)與再生起著重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫麗娟;秦軍;管曉麗;;去分化脂肪肉瘤復(fù)發(fā)1例報(bào)告[J];局解手術(shù)學(xué)雜志;2011年04期

2 呂國(guó)忠;周紅梅;趙朋;苗宗寧;錢海鑫;;體外培養(yǎng)表皮干細(xì)胞復(fù)合高分子支架原位修復(fù)深度燒傷創(chuàng)面的研究[J];中華損傷與修復(fù)雜志(電子版);2011年01期

3 陳蘭;黎暉;李春;曹佳會(huì);伍藝靈;劉洋;周健洪;陳東風(fēng);李伊為;;龜版有效成分抗無(wú)血清損傷表皮干細(xì)胞凋亡的研究[J];中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào);2011年08期

4 李美蓉;韓為東;付小兵;;獲得組織再生需要細(xì)胞類型的多種途徑[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2011年07期

5 黃林生;侯玲玲;李向臣;關(guān)偉軍;馬月輝;;牛表皮祖細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年18期

6 華南;;付小兵 創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域“冒”出的年輕院士[J];中華兒女;2011年14期

7 ;外源性信號(hào)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年27期

8 任賀;張磊;;拷問(wèn)誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的應(yīng)用前景[J];山東醫(yī)藥;2011年32期

9 李鋒生;梁偉國(guó);葉冬平;戴麗冰;陳鴻輝;;體外培養(yǎng)人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)性狀[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年28期

10 張潔;劉巍;朱新輝;周怡;;轉(zhuǎn)腺病毒-人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7軟骨細(xì)胞分泌的透明質(zhì)酸和Ⅱ型膠原[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年28期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張翠萍;付小兵;孫同柱;;去分化表皮干細(xì)胞的來(lái)源鑒定和分析[A];第七屆全國(guó)創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

2 張翠萍;付小兵;孫同柱;;去分化來(lái)源表皮干細(xì)胞的分離及表型特征觀察[A];第七屆全國(guó)創(chuàng)傷學(xué)術(shù)會(huì)議暨2009海峽兩岸創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)論壇論文匯編[C];2009年

3 李孝建;沈雁;張志;曾耀英;李延倉(cāng);楊小紅;;鼠表皮干細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白質(zhì)組差異表達(dá)的初步研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)燒傷外科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

4 王冰梅;葛香連;林程琳;宋穎楠;張彥定;;誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向成釉質(zhì)細(xì)胞分化[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

5 朱飛濱;劉德伍;張紅艷;彭燕;鐘清玲;李勇鐵;;P物質(zhì)聯(lián)合表皮干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合與神經(jīng)再生[A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

6 白曉智;張戰(zhàn)鳳;趙周婷;蔡維霞;石繼紅;湯朝武;朱雄翔;胡大海;;熱損傷后表皮細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向表皮干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)燒傷外科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

7 陶克;陳璧;丁國(guó)斌;謝松濤;王洪濤;胡大海;;聯(lián)合應(yīng)用3-甲基-1-異丁基黃嘌呤、胰島素、地塞米松對(duì)人胎兒表皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)燒傷外科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

8 鐘清玲;劉繁榮;劉德伍;;表皮干細(xì)胞向皮膚附件誘導(dǎo)分化研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)燒傷外科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

9 張楊;李秀蘭;華云旗;;表皮干細(xì)胞與毛囊干細(xì)胞生物學(xué)特性比較[A];第十五次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合瘍科學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2011年

10 謝曉繁;劉虎仙;付小兵;賈赤宇;;表皮干細(xì)胞分離和鑒定的研究進(jìn)展[A];2005'中國(guó)修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 張獻(xiàn)懷;我國(guó)創(chuàng)傷修復(fù)研究取得新進(jìn)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

2 張獻(xiàn)懷;我國(guó)創(chuàng)傷修復(fù)研究和臨床治療獲新進(jìn)展[N];大眾科技報(bào);2009年

3 張獻(xiàn)懷;我國(guó)創(chuàng)傷修復(fù)研究和臨床治療取得新進(jìn)展[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

4 張獻(xiàn)懷;創(chuàng)傷修復(fù)研究發(fā)現(xiàn)三種生物學(xué)現(xiàn)象[N];健康報(bào);2009年

5 記者　涂端玉 通訊員　陳景榮 鐘志勇;巨型老鼠體內(nèi)注有馬騮基因[N];廣州日?qǐng)?bào);2007年

6 張獻(xiàn)懷;解放軍總醫(yī)院一附院 科研創(chuàng)新碩果滿枝[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

7 壯錦;人工培育器官：中國(guó)科學(xué)家打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[N];新華每日電訊;2007年

8 本報(bào)通訊員 張獻(xiàn)懷 本報(bào)記者 仇方迎;“返老還童”有望夢(mèng)想成真[N];科技日?qǐng)?bào);2001年

9 景國(guó)勁（作者單位：集美大學(xué)藝術(shù)教育學(xué)院）;走向當(dāng)代藝術(shù)文化學(xué)[N];文藝報(bào);2005年

10 國(guó)務(wù)院國(guó)有資產(chǎn)監(jiān)督管理委員會(huì) 魏馳昊;統(tǒng)籌城鄉(xiāng)發(fā)展要促進(jìn)農(nóng)村土地和勞動(dòng)力合理流動(dòng)[N];中國(guó)經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙志力;去分化表皮細(xì)胞重獲再生表皮能力的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

2 孫曉艷;表皮細(xì)胞去分化形成表皮干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

3 李美蓉;表皮干細(xì)胞多向分化潛能特征的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

4 尹德龍;表皮干細(xì)胞在不同外界因素下對(duì)其生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2012年

5 蔡颯;非外源性基因干擾誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化及再生汗腺的臨床研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

6 郭永峰;人表皮細(xì)胞去分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2007年

7 王聯(lián)群;hTERT基因在人表皮干細(xì)胞中的表達(dá)與調(diào)控研究[D];南昌大學(xué);2010年

8 李孝建;鼠表皮干細(xì)胞培養(yǎng)體系及構(gòu)建組織工程皮膚的研究[D];暨南大學(xué);2009年

9 紀(jì)世召;模擬干細(xì)胞Niche同步實(shí)現(xiàn)表皮干細(xì)胞擴(kuò)增與皮膚替代物構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

10 韓軍濤;胎鼠表皮干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及其在表皮和毛囊再生中的作用[D];中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 費(fèi)陽(yáng);去分化來(lái)源表皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)及應(yīng)用研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2009年

2 陳萌;免疫熒光雙標(biāo)法應(yīng)用于小鼠表皮干細(xì)胞分子標(biāo)記的篩選[D];山東大學(xué);2011年

3 詹日興;一氧化氮在燒傷后表皮干細(xì)胞離巢遷移中作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

4 李云劍;培養(yǎng)基血清濃度對(duì)人表皮干細(xì)胞增殖分化的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

5 陳蘭;龜板有效成分對(duì)胎鼠表皮干細(xì)胞凋亡的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2011年

6 朱飛濱;P物質(zhì)聯(lián)合表皮干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合與神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究[D];南昌大學(xué);2011年

7 汪海儀;骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程中細(xì)胞去分化現(xiàn)象的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

8 陳季玲;急性β射線皮膚損傷創(chuàng)面及其表皮干細(xì)胞變化的實(shí)驗(yàn)研究[D];南華大學(xué);2012年

9 楊青;毛囊干細(xì)胞和表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

10 方碧清;堿性成纖維細(xì)胞因子對(duì)皮膚干細(xì)胞神經(jīng)分化影響的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

本文編號(hào)：1593009