本文選題：毛囊干細(xì)胞　切入點：表皮干細(xì)胞　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 1、建立高效、快速的兔FSCs (Follicle stem cells, FSCs)和ESCs (Epidermal stem cells, ESCs)分離、培養(yǎng)技術(shù),進(jìn)行原代與傳代細(xì)胞的培養(yǎng)。2、觀察體外培養(yǎng)的兔FSCs和ESCs生物學(xué)特征、細(xì)胞周期,并比較兩種細(xì)胞的差異。3、體外分離、培養(yǎng)人FSCs和ESCs,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。4、比較人FSCs和ESCs生物學(xué)特征。探討更合適組織工程皮膚的種子細(xì)胞,為體外構(gòu)建含有附屬器官的人工皮膚和實現(xiàn)大面積皮膚損傷從結(jié)構(gòu)修復(fù)到功能重建提供基礎(chǔ)。 方法： 1、采用兩步酶消化法從兔觸須部和腹部皮膚分別獲取FSCs和ESCs,進(jìn)行原代與傳代培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。 2、免疫組化檢測兔FSCs和ESCs的表面標(biāo)記物,β1整合素和角蛋白19(keratin19,K19)的表達(dá)差異。用MTT法考察FSCs和ESCs增殖活性。 3、采用流式細(xì)胞儀分析兔的第5代和第15代FSCs和ESCs各周期細(xì)胞的分布；比較經(jīng)傳代后兩種細(xì)胞的生物學(xué)活性。 4、用熒光定量PCR技術(shù)檢測傳代培養(yǎng)的FSCs和ESCs K19,βl整合素在mRNA水平上的表達(dá)差異。 5、采用單細(xì)胞法和組織塊法培養(yǎng),分離培養(yǎng)人頭皮來源的FSCs;分離培養(yǎng)人皮膚的ESCs,進(jìn)行原代和傳代細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。 6、比較人FSCs和ESCs體外貼壁時間、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長曲線和細(xì)胞增殖活性的差異。 結(jié)果： 1、采用兩步酶法成功地分離出兔的FSCs和ESCs,FSCs分離培養(yǎng)2天丌始有細(xì)胞貼壁,3天時貼壁的細(xì)胞有明顯的聚集傾向,7天后克隆增大丌始融合,傳代培養(yǎng)的FSCs貼壁迅速,細(xì)胞培養(yǎng)8天達(dá)到完全融合。ESCs培養(yǎng)10天細(xì)胞才有克隆樣生長趨勢;傳代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁緩慢,細(xì)胞培養(yǎng)2周80%融合。 2、免疫組化染色結(jié)果顯示,兔FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均陽性表達(dá)。FSCs和ESCs生長曲線的比較除第2天無明顯的差異外,從第6天丌始FSCs的增殖活性明顯高于ESCs,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),第10、14、18天FSCs的增殖活性逐漸增強,直到第26天,增殖活性開始下降；ESCs在第10天達(dá)到了增殖最高峰后細(xì)胞增殖活性迅速下降。FSCs顯示出持續(xù)高增殖,其高增殖時間是ESCs的2倍。 3、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示,傳代培養(yǎng)的FSCs和ESCs隨代次延長S期百分比和PI值均有下降,同代次細(xì)胞FSCsPI值大于ESCs。 4、熒光定量PCR檢測兔FSCs和ESCs的β1整合素和K19基因表達(dá),顯示FSCsβ1整合素和K19mRNA表達(dá)明顯高于ESCs。 5、“兩步酶”分離法可獲取大量人FSCs和ESCs;單細(xì)胞培養(yǎng)FSCs細(xì)胞大部分在24h內(nèi)貼壁,傳代細(xì)胞增殖迅速,3天左右達(dá)到80%以上融合。組織塊培養(yǎng)5天可見細(xì)胞在組織周圍爬出,細(xì)胞呈表皮樣。生長迅速,15天時可見表皮樣細(xì)胞周圍出現(xiàn)成纖維樣的細(xì)胞。ESCs培養(yǎng)3天時細(xì)胞多懸浮生長。傳代細(xì)胞增殖緩慢,培養(yǎng)7天細(xì)胞達(dá)到80%融合。 6、人FSCs和ESCs β1整合素、K19免疫染色均陽性。FSCs與ESCs生長曲線相比,FSCs具有更高的增殖活性且有一個相對較長高增殖活性的生長期。 結(jié)論： 1、“兩步酶”消化法是一種安全、高效的FSCs和ESCs的分離方法。可在較短時間內(nèi)為實驗研究提供大量目標(biāo)細(xì)胞。 2、人和兔來源的FSCs與ESCs均表達(dá)表皮干細(xì)胞標(biāo)志β1整合素和K19,且FSCs顯示高表達(dá)。 3、獲取的FSCs和ESCs均具有較高的增殖能力,經(jīng)體外培養(yǎng)的FSCs能在體外長時間擴增且細(xì)胞周期分布穩(wěn)定。 4、FSCs和ESCs均可以作為皮膚組織工程的種子細(xì)胞,FSCs不僅獲取容易且具有更高的增殖活性和多分化潛能,對構(gòu)建全層工程皮膚,FSCs更有優(yōu)勢。
[Abstract]:Objective:
1, the establishment of efficient, fast rabbit FSCs (Follicle stem cells, FSCs) and ESCs (Epidermal stem cells, ESCs) separation and culture technique,.2 were cultured in primary and passage cells, cultured rabbit FSCs and ESCs biological characteristics, cell cycle, and the difference between the two kinds of cells.3 in vitro. Isolation, culture of human FSCs and ESCs, was used to observe the morphology of.4, FSCs and ESCs to compare the biological characteristics of more suitable seed cells of tissue engineering skin, for in vitro artificial skin containing subsidiary organs and achieve a large area of skin injury and provide the basis from the structure of repair to the reconstruction of function.
Method錛，

本文編號：1592962