本文選題：大鼠　切入點：新生　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是新生兒期最常見的胃腸道急癥,主要發(fā)生于早產(chǎn)極低出生體重兒�；町a(chǎn)嬰中發(fā)病率約為1‰,早產(chǎn)極低體重兒發(fā)病率達(dá)7%；隨著現(xiàn)代NICU技術(shù)和新生兒學(xué)的發(fā)展,早產(chǎn)極低體重兒的存活率不斷提高,NEC發(fā)病率也有增加的趨勢。該病病死率高達(dá)15%-30%,存活者也常遺留不同程度的后遺癥,包括腸狹窄、短腸綜合征、反復(fù)發(fā)作的膿毒血癥、生長發(fā)育遲緩和神經(jīng)發(fā)育障礙等。嚴(yán)重病例常伴有腸壁壞死、穿孔、腹膜炎,全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官衰竭,病死率高達(dá)100%。雖然早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、腸缺氧缺血和異常的細(xì)菌定植是NEC的已知高危因素,但該病具體的發(fā)病機(jī)制仍未完全明了,也尚無確實有效的預(yù)防和治療措施。 最近研究認(rèn)為炎癥級聯(lián)反應(yīng)在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。有學(xué)者認(rèn)為NEC是早產(chǎn)兒特征性腸道菌群定植所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)失控而造成的。大量炎性介質(zhì)、受體和信號傳導(dǎo)通路參與該病的病理生理過程,但具體哪些在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用并可作為潛在的預(yù)防和治療的調(diào)控靶點并未清楚。 Toll樣受體是先天免疫模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)家族之一,廣泛表達(dá)于人體各種組織細(xì)胞中,可對病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)進(jìn)行識別、結(jié)合,并引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,啟動獲得性免疫應(yīng)答,是鏈接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁。TLR4是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類TLRs,也是目前研究的最為清楚的TLRs,其主要配體是G(-)菌細(xì)胞壁的脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)成分。近年來TLR4在新生兒NEC發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到重視。正常腸上皮細(xì)胞TLR4呈低表達(dá),而在NEC患兒和動物模型中均呈現(xiàn)高表達(dá)。早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、缺氧等NEC的高危因素均可導(dǎo)致TLR4表達(dá)增高。TLR4活化后可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB),進(jìn)而誘導(dǎo)下游炎性因子如IL-6、TNF-α等表達(dá),啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。大量的炎性介質(zhì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷和粘膜防御機(jī)制破壞,最終發(fā)展為NEC,并可誘導(dǎo)細(xì)菌易位(bacterial translocation, BT)和白細(xì)胞活化,刺激局部和全身細(xì)胞因子釋放,引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征,膿毒血癥和多器官衰竭。NEC可以在數(shù)小時內(nèi)從輕微癥狀迅速惡化為腸壞死、穿孔和腹膜炎等。因此,預(yù)防顯得尤為重要。 母乳含有多種生物活性物質(zhì),具有抗炎和抗微生物作用,可以減緩NEC的發(fā)生。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)是一種多效細(xì)胞因子不僅可促進(jìn)機(jī)體生成紅細(xì)胞,還具有多種非造血功能,如抗炎、抗凋亡和血管生成等。母乳和鼠乳中含有EPO,新生兒和新生鼠腸道中有EPO受體,提示EPO在胃腸道生長發(fā)育過程中可能具有生理學(xué)作用。Ledbetter等在一項回顧性研究中發(fā)現(xiàn)通過注射途徑給予EPO(200U/kg.d與營養(yǎng)液一起持續(xù)靜脈輸注,或400U/kg.次皮下注射,3次/周)預(yù)防和治療早產(chǎn)兒貧血,結(jié)果接受治療的早產(chǎn)兒其壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生率明顯低于未接受EPO治療的早產(chǎn)兒,提示EPO可能在壞死性小腸結(jié)腸炎的預(yù)防和治療中有重要的作用。但是注射給藥有可能造成局部皮膚感染；另外由于EPO受體廣泛分布、表達(dá)于各種非造血組織,經(jīng)注射途徑給藥會造成全身不良反應(yīng),而經(jīng)腸道給藥作用于局部,很少全身吸收。 本研究采用人工喂養(yǎng)及缺氧冷刺激建立新生大鼠NEC模型,在代乳品中添加近似母乳生理濃度的EPO進(jìn)行干預(yù),觀察經(jīng)腸道補(bǔ)充EPO對新生大鼠腸組織TLR4、NF-κB、IL-6、SIgA、MUC2動態(tài)變化及腸損傷和細(xì)菌易位的影響,探討EPO對NEC的保護(hù)作用及可能機(jī)制。 實驗材料及方法 一、實驗材料 1、實驗動物：SPF級3日齡SD新生大鼠,雌雄不限,體質(zhì)量5.12～10.20g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,合格證號SCXK(粵)2008-0020,使用許可證號SYXK(粵)2008-0092。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗中心SPF級動物實驗室(動物實驗環(huán)境設(shè)施監(jiān)測合格證號：粵監(jiān)證字2008C067號),室內(nèi)溫度28℃～30℃,濕度45%-65%,采用12h/12h晝夜間斷照明。 2、主要試劑及藥品：惠氏S-26金裝愛兒加早產(chǎn)奶粉(美國惠氏公司)大鼠IL-6ELISA檢測試劑盒(RD公司,美國),大鼠MUC2ELISA檢測試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司),大鼠SIgA ELISA檢測試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司),促紅細(xì)胞生成素(沈陽三生制藥有限公司產(chǎn)品) 3、主要儀器：BX50光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司),RM2255型石蠟切片機(jī)(德國LeiCA公司),7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司),9700PCR儀(美國ABI公司) 二、實驗方法 1、新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型的建立參照文獻(xiàn),采用鼠代乳品人上喂養(yǎng)及缺氧冷刺激(100%氮氣缺氧90s、4℃冷刺激10min,每天3次,連續(xù)3d)的方法建立新生大鼠NEC模型；代乳品的配置參考Auestad等的方法,3大營養(yǎng)物質(zhì)的含量及熱卡分別為脂肪116.3g·L-1,蛋白質(zhì)107g·L-1,糖類27g·L-1,熱量6616kJ·L-1,采用24G的硅膠管4次/日灌胃進(jìn)行人工喂養(yǎng),首次喂養(yǎng)量為0.15m1,逐漸增加到0.35ml。 2、實驗方案及標(biāo)本采集和處理 實驗1：研究EPO對新生大鼠NEC模型腸損傷及細(xì)菌易位的影響,75只新生大鼠隨機(jī)分為以下3組,每組25只。正常對照組(normal control group):新生大鼠繼續(xù)與母鼠同籠,鼠乳喂養(yǎng),不做任何干預(yù)。NEC模型組(NEC model group, NEC):新生大鼠與母鼠分離,置于保育箱中,采用鼠代乳品人工喂養(yǎng),并定期給予缺氧冷刺激(100%氮氣缺氧90s、4℃冷刺激10min,每天3次,連續(xù)3d),以建立新生大鼠NEC模型。EPO干預(yù)組(EPO intervention group, NEC+EPO):采用代乳品中添加與母乳生理濃度相近的EPO(0.1u/ml)人工喂養(yǎng),同時予缺氧冷刺激。各組動物于造模后72h心臟穿刺采血后處死,按以下方法處理和保存標(biāo)本： (1)采血0.05m1置于EDTA.K2抗凝管中,-80℃冰箱保存,用于總細(xì)菌DNA檢測。 (2)留取近回盲部末端回腸2cm固定于10%中性甲醛中,石蠟包埋、制成3μm切片,HE染色后做組織病理學(xué)檢查。 實驗2：研究EPO對新生大鼠NEC模型腸組織TLR4、NF-κB、IL-6、SIgA、MUC2動態(tài)變化的影響,90只新生大鼠按以上實驗方案隨機(jī)分為3組,每組30只。各組動物于造模后24、48、72h分別心臟采血后處死10只大鼠,切取末端回腸3cm,平均分成二部分。一部分在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中漂洗后-80℃保存,用于定量RT-PCR、ELISA研究；另一部分固定于10%中性甲醛中,石蠟包埋,制成3μm切片,HE染色后做組織病理學(xué)檢查。 3、觀察指標(biāo)和檢測方法 (1)每天觀察大鼠一般狀態(tài)、排便、體重及死亡情況。 (2)病理形態(tài)學(xué)研究 ①各組動物于各時間點處死后,打開腹腔肉眼觀察腸腔積氣、出血、壞死等NEC樣病變。 ②光鏡觀察：回腸組織常規(guī)固定后,HE染色,光鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化并進(jìn)行組織損傷評分,腸組織病理評分參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)：0分,腸絨毛及上皮完整,組織結(jié)構(gòu)正常；1分,輕微黏膜下和(或)固有層腫脹分離；2分,中度黏膜下和(或)固有層腫脹分離,黏膜下和(或)肌肉層水腫；3分,重度黏膜下和(或)固有層腫脹分離,黏膜下和(或)肌肉層水腫,局部絨毛脫落；4分,腸絨毛消失伴腸壞死。取樣品中觀察到的最高分?jǐn)?shù)確定腸道的損傷程度,組織學(xué)評分≥2分確定為NEC。 (3)細(xì)菌易位檢測：實時熒光定量PCR檢測血標(biāo)本中細(xì)菌16S rRNA基因。在40個PCR循環(huán)內(nèi),有Ct值的標(biāo)本判斷為細(xì)菌DNA陽性,表明發(fā)生了細(xì)菌易位：無Ct值的標(biāo)本判斷為細(xì)菌DNA陰性,表明未發(fā)生細(xì)菌易位。 (4)實時熒光定量PCR檢測回腸組織TLR4、NF-κB mRNA的動態(tài)變化。 (5) ELISA法檢測回腸IL-6、SIgA、MUC2的動態(tài)變化。 4、統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料結(jié)果以x±s表示。多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。腸組織病理評分比較采用Kruskal-Wallis H檢驗；發(fā)病率和細(xì)菌易位發(fā)生率比較采用χ2檢驗;P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 實驗1結(jié)果 一、大鼠的一般情況正常對照組大鼠生長發(fā)育良好；NEC模型組大鼠造模48-72h后相繼出現(xiàn)腹脹、腹瀉,活動減少,神倦嗜睡,體質(zhì)量下降等；嚴(yán)重者出現(xiàn)頻繁嘔吐,紫紺,呼吸窘迫和蒼白。EPO干預(yù)組上述癥狀明顯減少,體質(zhì)量緩慢增長。有3只大鼠(NEC模型組2只、EPO治療組1只)因喂養(yǎng)問題于造模72h內(nèi)死亡,各組動物存活率為：正常對照組100%(25/25),NEC模型組92%(23/25),EPO治療組96%(24/25)。 二、大鼠腸組織病理學(xué)變化 1.大體形態(tài)改變NEC模型組大鼠腸組織充血、水腫、腸腔積氣、擴(kuò)張明顯；EPO干預(yù)組大鼠腸腔擴(kuò)張、積氣較模型組減輕；正常對照組大鼠腸組織無異常改變。 2.光鏡下病理變化正常對照組腸絨毛完整,上皮細(xì)胞排列整齊,無明顯異常改變。NEC模型組腸上皮細(xì)胞排列紊亂,絨毛間質(zhì)充血,細(xì)胞水腫,部分絨毛壞死、脫落消失,黏膜下和固有層分離,黏膜下和肌肉層水腫,肌層變薄,大量炎性細(xì)胞浸潤。EPO-干預(yù)組與模型組相比,腸絨毛充血、水腫較輕,炎性細(xì)胞浸潤減少。三組大鼠腸組織病理學(xué)評分(平均秩和分別為17.6800,53.8696,39.4583)差異有統(tǒng)計學(xué)意義：3個樣本間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) 三.NEC發(fā)病率根據(jù)組織病理評分判斷各組大鼠NEC發(fā)病率,結(jié)果為正常對照組0%(0/25),NEC模型組57%(13/23),EPO治療組25%(6/24)。EPO干預(yù)組發(fā)病率明顯低于NEC模型組[25%(6/24)vs57%(13/23)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 四.細(xì)菌易位發(fā)生率根據(jù)血標(biāo)本16SrRNA實時熒光定量PCR檢測結(jié)果判斷各組大鼠BT發(fā)生率：結(jié)果為正常對照組0%(0/25),NEC模型組65%(15/23),EPO治療組17%(4/24)。EPO干預(yù)組BT發(fā)生率明顯低于NEC模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 實驗2結(jié)果 一.各組動物回腸組織TLR4、NF-κB mRNA及IL-6動態(tài)表達(dá)正常對照組TLR4、NF-κB mRNA及IL-6呈穩(wěn)態(tài)低表達(dá)。NEC模型組TLR4mRNA在24h出現(xiàn)高表達(dá),峰值在48h,72h略有下降,各時間點表達(dá)值均較正常對照組明顯升高(P0.01)；EPO干預(yù)組TLR4mRNA24h也出現(xiàn)高表達(dá),但隨后迅速下降,48h和72h表達(dá)值明顯低于NEC模型組(P0.01)。NEC模型組NF-KBmRNA、IL-6表達(dá)值在48、72h明顯高于正常對照組(P0.01)；EPO干預(yù)組在48h也出現(xiàn)高表達(dá),72h明顯低于NEC模型組護(hù)0.01)。 二.各組動物回腸組織MUC2及SIgA的動態(tài)表達(dá)正常對照組MUC2呈平均穩(wěn)態(tài)表達(dá);NEC模型組MUC2在24h出現(xiàn)低表達(dá),而48h迅速回升接近正常對照組水平,72h后處于穩(wěn)態(tài)表達(dá)；EPO干預(yù)組造模24h未出現(xiàn)表達(dá)下降,48h后迅速升高超過正常對照組水平,72h后達(dá)峰值。NEC模型組除24h表達(dá)值較正常對照組降低外(P0.01),48h、72h時無統(tǒng)計學(xué)差異。EPO干預(yù)組72h表達(dá)值較正常對照組和NEC模型組均明顯升高(P0.05)。正常對照組SIgA呈平均穩(wěn)態(tài)表達(dá)；NEC模型組表達(dá)呈遞減趨勢,各時間點表達(dá)值均低于正常對照組(P0.01)；EPO干預(yù)組24h也出現(xiàn)低表達(dá),48h后逐漸回升,72h接近正常對照組水平。與正常對照組比較,EPO干預(yù)組24、48h表達(dá)值降低(P0.01),72h時無統(tǒng)計學(xué)差異；和NEC模型組比較,EPO干預(yù)組72h明顯升高(P0.01)。 三.各組動物腸組織損傷動態(tài)變化造模48h內(nèi)各組動物均未出現(xiàn)NEC樣組織病理損傷,72h后模型組和EPO干預(yù)組出現(xiàn)組織損傷,模型組評分(2.83±0.56)明顯高于EPO干預(yù)組(1.53±0.35),P0.01。 結(jié)論 一.人工喂養(yǎng)及缺氧冷刺激可誘導(dǎo)新生大鼠腸組織產(chǎn)生接近人類新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎樣病理改變；經(jīng)腸道給予生理濃度的EPO可改善新生大鼠NEC模型臨床癥狀,減輕腸組織損傷,降低發(fā)病率。 二.新生大鼠NEC模型中先天免疫應(yīng)答啟動早于獲得性免疫應(yīng)答,炎癥反應(yīng)早于腸道組織損傷,炎癥反應(yīng)是因,組織損傷是果；經(jīng)腸道給予生理濃度的EPO可下調(diào)TLR4表達(dá),抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生,從而減輕腸道組織損傷。 三.新生大鼠NEC模型中腸組織黏膜屏障功能受損,經(jīng)腸道給予生理濃度的EPO可上調(diào)MUC2及SIgA表達(dá),從而保護(hù)腸黏膜機(jī)械、免疫屏障功能。 四.細(xì)菌易位參與NEC的發(fā)病過程,EPO可有效減緩細(xì)菌易位的發(fā)生。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R722.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳曉晴;許華;羅小平;;促紅細(xì)胞生成素對壞死性小腸結(jié)腸炎TLR4、NF-κB及IL-6變化的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2011年09期

2 陳曉晴;羅小平;;促紅細(xì)胞生成素對新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型腸損傷及細(xì)菌易位的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2012年05期

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本文編號：1592502