本文選題：TLR2　切入點(diǎn)：TLR4　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 ①通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討軍團(tuán)菌活菌刺激對(duì)健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）表達(dá)TLR2mRNA、TLR4mRNA的影響，初步闡明TLR2、TLR4在軍團(tuán)菌感染過(guò)程的作用機(jī)制。 ②探討相關(guān)細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α）在軍團(tuán)菌感染中的作用。 ③探討TLR4(2244G→A)位點(diǎn)基因多態(tài)性與TNF-α和IL-6表達(dá)的關(guān)系。 方法 ①由太原市紅十字血液中心取健康人（n=30）40mL外周血，分離PBMC前保留5mL外周血，以備TLR4 SNP分型檢測(cè)，密度梯度離心法分離PBMC，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，以每孔2×10~6個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，于37℃，5％CO2條件下，培養(yǎng)24 h。 ②培養(yǎng)24h后，將24孔板取出，將健康人PBMC分為正常對(duì)照組和軍團(tuán)菌刺激組，軍團(tuán)菌刺激組分別加入500μL2×10~6/mL(MOI1組)、2×107/mL(MOI10組)2個(gè)不同濃度的軍團(tuán)菌懸液，3組分別做復(fù)孔。37℃, 5%CO2條件下，孵育2h，待軍團(tuán)菌進(jìn)入貼壁細(xì)胞后，棄上清，用1mL磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入1mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃, 5%CO2條件下培養(yǎng),分別在18、24、72 h時(shí)，收獲細(xì)胞提取總RNA。各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液保存于-80℃用于IL-6、TNF-α的檢測(cè)。 ③采用Real-time RT-PCR法測(cè)定TLR2、TLR4、MyD88 mRNA的表達(dá)水平。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α）表達(dá)水平。 ④采用SNaPshot技術(shù)進(jìn)行TLR4 SNP分型檢測(cè)。 ⑤采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入和分析。 結(jié)果 ①析因分析結(jié)果顯示，時(shí)間的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.06，p0.05）；時(shí)間與濃度的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.39，p0.05）。18h時(shí),各組之間TLR2mRNA的表達(dá)量差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),但表達(dá)量隨濃度升高呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；24h時(shí),MOI1、MOI10刺激組TLR2 mRNA的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(p0.05)，呈現(xiàn)隨菌液濃度升高表達(dá)量也逐漸升高；72h時(shí)，各組之間TLR2mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)，但呈現(xiàn)隨菌液濃度升高表達(dá)量反而降低。各濃度之間TLR4mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.074，p=0.929）；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.782，p=0.000),分組和時(shí)間點(diǎn)之間交互作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.948，，p=0.440）。 ②各時(shí)間點(diǎn)IL-6的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(F=8.68，p0.05)呈現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)，IL-6的表達(dá)量逐漸升高；對(duì)照組和MOI10 IL-6的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(F=94.47，p0.05)；時(shí)間與濃度的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.55，p0.05）。各時(shí)間點(diǎn)TNF-a的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(F=3.324，p0.05)，呈現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-a的表達(dá)量逐漸升高；對(duì)照組和MOI10 TNF-a的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(F=4.511，p0.05)；時(shí)間與濃度的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.283，p0.05）。 ③健康人GA/AA基因型組TNF-α濃度高于GG基因型組，但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-1.200, p =0.235）；GA/AA基因型組IL-6濃度高于GG基因型組，但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Z=-1.609, p =0.116）。 結(jié)論： ①本次研究發(fā)現(xiàn)TLR2可能參與抗軍團(tuán)菌感染，TLR4、MyD88尚未發(fā)現(xiàn)參與抗軍團(tuán)菌感染。 ②IL-6和TNF-α與軍團(tuán)菌感染有關(guān)。 ③GA/AA基因型可能是軍團(tuán)菌感染的保護(hù)因素。
[Abstract]:Purpose. 1 to investigate the effect of live Legionella on the expression of TLR2mRNA-TLR4 mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy people in vitro, and to elucidate the mechanism of TLR2mRNA-TLR4 in the process of Legionella infection. 2 to investigate the role of IL-6 TNF- 偽 in Legionella infection. 3 discussion on TLR4(2244G. 鈫扵he relationship between gene polymorphism and expression of TNF- 偽 and IL-6. Method. 1from the Red Cross Blood Center of Taiyuan City, 40 mL peripheral blood of healthy people was collected, and 5 mL of peripheral blood was retained before PBMC isolation for TLR4 SNP typing. PBMC was isolated by density gradient centrifugation, and the number of living cells was counted by trypan blue staining. 2 脳 10 ~ 6 cells per pore were inoculated on 24 well plate. Cultured at 37 鈩

本文編號(hào)：1585642