發(fā)布時間：2018-03-08 00:08

  本文選題：牛類胚胎干細胞　切入點：飼養(yǎng)層　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：胚胎干細胞(Embryonic stem cell,簡稱ES細胞),是從哺乳動物早期胚胎的內(nèi)細胞團(Inner cell mass, ICM)或原始生殖細胞(Primordial germcell, PGCs)中分離出來,經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)獲得的具有無限增殖能力和保持未分化狀態(tài)的細胞系。該細胞系具有胚胎細胞與普通培養(yǎng)細胞的雙重特性,其具有正常的二倍體核型,具有發(fā)育的全能性和多能性,并可無限增殖、冷凍保存及進行基因遺傳操作。牛作為家畜中重要的動物,其ES細胞的建立具有廣闊的應(yīng)用前景。如何克服牛ES細胞建系中存在的問題,找到適合牛ES細胞生長增殖的環(huán)境已成為現(xiàn)在亟待解決的問題。本研究比較了飼養(yǎng)層的種類和密度、胚胎的處理方法及不同培養(yǎng)液對牛類胚胎干細胞培養(yǎng)的影響,并采用DDRT-PCR和Western blotting技術(shù)從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上觀察了不同形態(tài)和不同代次牛類胚胎干細胞基因表達的差異,以便為建立牛胚胎干細胞培養(yǎng)體系提供實驗依據(jù)。 一、飼養(yǎng)層對牛胚胎干細胞的影響 1.小鼠胎兒成纖維細胞和牛胎兒成纖維細胞做飼養(yǎng)層對牛類胚胎干細胞培養(yǎng)的影響 分別用小鼠胎兒成纖維細胞(MEF)和牛胎兒成纖維細胞(BEF)做飼養(yǎng)層對牛類胚胎干細胞進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)兩種飼養(yǎng)層都可形成具有干細胞形態(tài)特征的克隆。在BEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下干細胞生長速度慢,干細胞傳至第五代后克隆邊緣細胞與飼養(yǎng)層細胞融合,界限模糊。而在MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下干細胞生長速度快,干細胞傳至第十代仍保持未分化狀態(tài)。 2.飼養(yǎng)層密度對牛類胚胎干細胞的影響 比較三種不同密度的小鼠胎兒成纖維細胞做飼養(yǎng)層對牛類胚胎干細胞分離培養(yǎng)的影響。結(jié)果顯示,在密度為1.25×105/ml的飼養(yǎng)層上囊胚貼壁時間短,貼壁率高,初代克隆形成率高,最適合牛類胚胎干細胞的分離培養(yǎng)。 二、囊胚的處理方法和接種密度對牛類胚胎干細胞分離的影響 1.囊胚處理方法對牛類胚胎干細胞分離的影響 本研究中分別采用鏈酶蛋白酶去除透明帶的囊胚、自然孵化囊胚以及機械切割得到的內(nèi)細胞團進行牛類胚胎干細胞分離培養(yǎng)。結(jié)果顯示,自然孵化的囊胚貼壁時間短,貼壁率高,更有利于牛類胚胎干細胞的分離培養(yǎng)。 2.囊胚接種密度對牛類胚胎干細胞分離的影響 將自然孵化囊胚接種在24孔板中,每孔接種1-4枚囊胚。結(jié)果顯示,每孔接種2枚囊胚的原代克隆率最高為76%。 三、血清和IGF1對牛類胚胎干細胞分離的影響 以密度為1.25×105/ml的胎鼠成纖維細胞為飼養(yǎng)層,24孔板每孔接種兩枚自然孵化囊胚,用三種不同的培養(yǎng)液培養(yǎng)牛類胚胎干細胞,來確定血清和IGF1因子對牛類胚胎干細胞培養(yǎng)的影響。結(jié)果顯示,普通血清和干細胞專用血清對牛類胚胎干細胞培養(yǎng)的影響不明顯；添加10ng/mlIGF1的培養(yǎng)液,培養(yǎng)的牛類胚胎干細胞克隆集落生長最旺盛,形成的克隆最大,但傳至五代后細胞明顯分化,表明IGFl會促進牛類胚胎干細胞的生長但不利于干細胞多能性的維持。 四、牛類胚胎干細胞的鑒定 用DMEM/F12+15%FBS+0.1mMβ-巰基乙醇+O.1mM非必需氨基酸+雙抗+10ng/ml LIF+10ng/ml bFGF培養(yǎng)液培養(yǎng)的牛類胚胎干細胞進行OCT-4、SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-61的免疫熒光檢測和Nanog、Oct-4和Sox-2的RT-PCR檢測,結(jié)果均為陽性。并對不同形態(tài)和代次的牛類胚胎干細胞做了堿性磷酸酶檢測,結(jié)果為陽性。證明了本實驗所培養(yǎng)和收集的牛類胚胎干細胞具有干細胞特性。 五、不同形態(tài)牛類胚胎干細胞的mRNA差異顯示與鑒定 1.差異基因的mRNA表達量檢測 本研究利用DDRT-PCR篩選片狀、塊狀與泡狀三種形態(tài)牛類胚胎干細胞差異表達的基因,并用實時定量PCR(Real Time Quantitative PCR)分析差異基因在不同發(fā)育階段的表達豐度。篩選得到6個差異片段,經(jīng)測序和GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析,這6個片段與已知基因有較高的同源性,分別為RPL9、LOC100850994、AMP、RPL31、Erbb2ip、CLIP1。通過實時定量PCR檢測這6個基因的表達量,并用SPSS統(tǒng)計分析軟件對實時數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計,結(jié)果表明,RPL9在塊狀和泡狀中的表達量分別是片狀的0.67倍和1.46倍(P0.01)；LOC100850994在塊狀和泡狀中的表達量分別是片狀的0.33和2.73倍(P0.01)；RPL31在塊狀和泡狀中的表達量分別是片狀的0.71(P0.05)和1.58倍(P0.01)；AMP、Erbb2IP和CLIP1在片狀與塊狀中的表達量無顯著差異(P0.05),而在泡狀中的表達量分別為片狀的2.11、1.43和1.61倍(P0.05)。 2.差異基因的蛋白表達量檢測 用Western blotting檢測各差異基因在不同形態(tài)中蛋白表達情況,以片狀牛類胚胎干細胞為校準組,以a-tubulin為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示,RPL9在片狀細胞中表達量最高,泡狀次之,塊狀細胞中表達量最低(P0.05)；RPL31在片狀和泡狀細胞中表達量基本相同(P0.05),在塊狀細胞中表達量顯著降低(P0.05)；AMP和CLIP1在三種形態(tài)中的蛋白表達量沒有顯著差異(P0.05)。 六、不同代次牛類胚胎干細胞的mRNA差異顯示與鑒定 1.差異基因的]mRNA表達量檢測 本研究利用DDRT-PCR篩選第一、五和十代不同代次牛類胚胎干細胞差異表達的基因,并用實時定量PCR(Real Time Quantitative PCR)分析差異基因在不同發(fā)育階段的表達豐度。結(jié)果篩選得到7個差異片段,經(jīng)測序和GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析,這7個片段與已知基因有較高的同源性,分別為IK、TKDP1、BZW、RPL31、PRL9、 RP42、IGBP1。通過實時定量PCR檢測這7個基因的表達量,并用SPSS統(tǒng)計分析軟件對實時數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計,結(jié)果表明,IK、TKDP1、 BZW、PRL9、RP42、IGBP1在第十代中的表達量較第一代均顯著降低(P0.05),僅RPL31表達量無顯著差異(P0.05)。 2.差異基因的蛋白表達量檢測 用Western bloting檢測各差異基因在不同代次中蛋白表達情況,以第一代牛類胚胎干細胞為校準組,以α-tubulin為內(nèi)參基因。結(jié)果顯示,各檢測蛋白在第一代的表達量均顯著高于第十代(P0.05)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1581551