發(fā)布時間：2018-03-07 23:16

  本文選題：神經(jīng)干細(xì)胞　切入點：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的]探討SD大鼠源性嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells, OECs)、雪旺細(xì)胞(schwann cells, SCs)分別對神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone morrow stromal cells, BMSCs)、造血干細(xì)胞(haemopoietic stem cells, HSCs)活力、增殖、分化、營養(yǎng)因子表達(dá)的影響,為應(yīng)用支持細(xì)胞聯(lián)合于細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論和實驗依據(jù)。 [方法]本實驗分為NSCs單獨培養(yǎng)組、NSCs/OECs共培養(yǎng)組、NSCs/SCs共培養(yǎng)組；BMSCs單獨培養(yǎng)組、BMSCs/OECs共培養(yǎng)組、BMSCs/SCs共培養(yǎng)組；HSCs單獨培養(yǎng)組、HSCs/OECs共培養(yǎng)組及HSCs/SCs共培養(yǎng)組。體外分別取材、純化、傳代培養(yǎng)NSCs、BMSCs、HSCs、OECs、SCs至第三代并分別進(jìn)行細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物nestin、CD44、CD34、P75、S100染色鑒定,再將已鑒定的第三代OECs、SCs分別與NSCs、BMSCs、HSCs在Millipore嵌入性培養(yǎng)板中共培養(yǎng)7天,以單獨培養(yǎng)組單獨組為對照觀察各組干細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、神經(jīng)球數(shù)量及大小變化；MTT檢測各組干細(xì)胞活力；用免疫組織化學(xué)(IHC)染色以β-TubulinⅢ、NF、Neun、Gale、GFAP為標(biāo)記了解各干細(xì)胞分化情況；用RT-PCR檢測部分神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體的表達(dá)情況。使用Image-Pro Plus和Image J軟件對實驗圖片進(jìn)行計數(shù)及灰度測量,用SPSS13.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 [結(jié)果] 1、體外細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：培養(yǎng)的NSCs、BMSCs、HSCs、OECs、SCs分別經(jīng)nestin、CD44、CD34、P75、S100 IHC染色鑒定呈陽性反應(yīng)。 2、細(xì)胞計數(shù)結(jié)果： 2.1與OECs共培養(yǎng)后的BMSCs(114±23.4)和與SCs共培養(yǎng)后的BMSCs(134.2±14.0)的細(xì)胞數(shù)量均較BMSCs單獨培養(yǎng)組(61.4±15.0)增多；且SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組亦較OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組多,均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)： 2.2與OECs共培養(yǎng)后的HSCs(109.0±17.8)和與SCs共培養(yǎng)后的HSCs(180.5±24.5)的細(xì)胞數(shù)量均較HSCs單獨培養(yǎng)組(95.4±18.9)明顯增多；且SCs共培養(yǎng)后的HSCs組亦較OECs共培養(yǎng)后的HSCs組多,均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 3、神經(jīng)球計數(shù)及直徑測量： 3.1 OECs共培養(yǎng)后的NSCs組(68.9±15.8)和SCs共培養(yǎng)后的NSCs組(64.7±10.7)的神經(jīng)球數(shù)量均較NSCs單獨培養(yǎng)組(50.3±9.8)明顯增多,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；而OECs共培養(yǎng)后的NSCs組與SCs共培養(yǎng)后的NSCs組比較無統(tǒng)計學(xué)差異； 3.2 OECs共培養(yǎng)后的NSCs組(154.1±69.3Pixels)和SCs共培養(yǎng)后的NSCs組(188.3±73.4 Pixels)的神經(jīng)球直徑均較NSCs單獨培養(yǎng)組(109.8±50.5Pixels)明顯增大；且SCs共培養(yǎng)后的NSCs組亦較OECs共培養(yǎng)后的NSCs組神經(jīng)球直徑大,均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 4、MTT檢測結(jié)果： 4.1 OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組(0.149±0.006)和SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組(0.188±0.007)的細(xì)胞MTT檢測值均較BMSCs單獨培養(yǎng)組(0.117±0.007)增高；且SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組亦較OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組高,均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)； 4.2 OECs共培養(yǎng)后的HSCs組(0.197±0.029)和SCs共培養(yǎng)后的HSCs組(0.339±0.089)的細(xì)胞MTT檢測值均較HSCs單獨培養(yǎng)組(0.167±0.016)明顯增高,且SCs共培養(yǎng)后的HSCs組亦較OECs共培養(yǎng)后的HSCs組高,均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)； 4.3 OECs共培養(yǎng)后的NSCs組(0.249±0.018)和SCs共培養(yǎng)后的NSCs組(0.197±0.020)的細(xì)胞MTT檢測值均較NSCs單獨培養(yǎng)組(0.160±0.012)增高,且OECs共培養(yǎng)后的NSCs組亦較SCs共培養(yǎng)后的NSCs組高,均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 5、IHC染色分化指標(biāo)： 5.1 BMSCs各組ICH染色結(jié)果： 分化指標(biāo)β-TubulinⅢNF、Neun、Galc、GFAP的IHC染色顯示：SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組β-TubulinⅢ(10.1±3.3%)、Neun (18.3±8.9%)、NF(7.6±5.3%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均較OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組(7.5±2.4%、12.3±4.3%、2.4±1.3%)和BMSCs單獨培養(yǎng)組(6.9±3.7%、12.6±±5.1%、0.0±0.0%)明顯增多,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組僅NF陽性百分?jǐn)?shù)較BMSCs單獨培養(yǎng)組多,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而兩組間β-TubulinⅢNeun陽性百分?jǐn)?shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；BMSCs單獨培養(yǎng)組、OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組及SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組Galc染色均呈陽性,測得三組灰度值比較顯示SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組(0.29±0.04)和OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組(0.28±0.04)灰度值均較BMSCs單獨培養(yǎng)組(0.26±0.04)增高,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組和OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；BMSCs單獨培養(yǎng)組、OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組及SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組三組GFAP染色均呈陰性。 5.2HSCs各組IHC染色結(jié)果： SCs共培養(yǎng)后的HSCs組β-TubulinⅢ(94.0±2.2%)、Neun (92.2±3.3%)、NF(95.0±1.6%)、Galc(96.4±1.4%)、GFAP (91.9±2.6%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和OECs共培養(yǎng)后的HSCs組β-TubulinⅢ(94.5±1.7%)、Neun (94.6±2.2%)、NF (94.8±2.2%)、Galc (96.3±1.8%)、GFAP (94.8±2.1%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均較HSCs單獨培養(yǎng)組(43.9±8.0%、49.8±9.3%、50.5±7.3%、58.7±4.2%、39.1±5.2%)明顯增多,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而OECs共培養(yǎng)后的HSCs組與SCs共培養(yǎng)后的HSCs組間其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5.3NSCs各組IHC染色結(jié)果： SCs共培養(yǎng)后的NSCs組Neun(46.7±8.8%)、NF(44.5±11.9%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和OECs共培養(yǎng)后的NSCs組Neun(31.5±7.5%)、NF(35.2±5.5%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均較NSCs單獨培養(yǎng)組(24.6±6.0%、28.3±7.8%)明顯增多,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而OECs共培養(yǎng)后的NSCs組與SCs共培養(yǎng)后的NSCs組間其差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；OECs共培養(yǎng)后的NSCs組β-TubulinⅢ(85.1±7.1%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較NSCs單獨培養(yǎng)組(75.6±13.5%)明顯增多,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而SCs共培養(yǎng)后的NSCs組β-TubulinⅢ(40.7±7.8%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較NSCs單獨培養(yǎng)組明顯減少,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),且OECs共培養(yǎng)后的NSCs組和SCs共培養(yǎng)后的NSCs組間比較亦有顯著差異(p0.05)；SCs共培養(yǎng)后的NSCs組Galc (22.9±9.9%)、GFAP (15.7±10.7%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和OECs共培養(yǎng)后的NSCs組Galc (21.7±7.8%)、GFAP(18.6±7.2%)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均較NSCs單獨培養(yǎng)組(43.8±16.5%、33.4±15.8%)減少,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),而OECs共培養(yǎng)后的NSCs組與SCs共培養(yǎng)后的NSCs組間其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 6、RT-PCR檢測： 6.1 BMSCs各組營養(yǎng)因子及受體表達(dá)情況： SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組和OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組營養(yǎng)因子BDNF、CNTF、IGF-1、NGF、PDGF、TGF-β1、TGF-β2、VEGF及受體TrkC表達(dá)與BMSCs單獨培養(yǎng)組比較無明顯差異(p0.05)；而OECs共培養(yǎng)后的BMSCs組TrkB(0.71±0.19)表達(dá)較對照組BMSCs單獨培養(yǎng)組(0.43±0.21)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.039,0.05)；SCs共培養(yǎng)后的BMSCs組TrkA(0.14±0.13)表達(dá)較對照組BMSCs單獨培養(yǎng)組(0.37±0.20)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.034,0.05)。 6.2 NSCs各組營養(yǎng)因子及受體表達(dá)情況： OECs共培養(yǎng)后的NSCs組、SCs共培養(yǎng)后的NSCs組及NSCs單獨培養(yǎng)組三組間CNTF、IGF-1、TGF-β1、TGF-β2、TrkA表達(dá)無明顯差異(p0.05)；而OECs共培養(yǎng)后的NSCs組和SCs共培養(yǎng)后的NSCs組BDNF (0.09±0.07, 0.22±0.13)、NGF (0.24±0.12,0.61±0.31)、PDGF (0.07±0.08,0.13±0.06)、TrkB(0.32±0.13,0.51±0.11)表達(dá)較NSCs單獨培養(yǎng)組(0.69±0.46,1.46±0.37,0.44±0.16,1.05±0.44)均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；OECs共培養(yǎng)后的NSCs組VEGF(0.16±0.10)表達(dá)較NSCs單獨培養(yǎng)組(0.26±0.05)亦減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；而SCs共培養(yǎng)后的NSCs組TrkC(0.71±0.15)表達(dá)較NSCs單獨培養(yǎng)組(0.54±0.12)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.0170.05)；6.3 HSCs各組營養(yǎng)因子及受體表達(dá)情況： OECs共培養(yǎng)后的HSCs組、SCs共培養(yǎng)后的HSCs組及HSCs單獨培養(yǎng)組三組間TrkA表達(dá)無明顯差異(p0.05)；SCs共培養(yǎng)后的HSCs組BDNF (0.93±0.15、CNTF (0.61±0.28)、PDGF(0.64±0.50)、TGF-β1 (1.53±0.25)、TGF-β2 (1.01±0.45)、VEGF (0.19±0.15)及TrkB (1.26±0.33)、TrkC(0.81±0.49)表達(dá)較HSCs單獨培養(yǎng)組(0.30±0.23,0.09±0.09,0.16±0.15,0.95±0.11,0.26±0.23,0.06±0.04,0.58±0.60,0.26±0.10)增加,其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；而OECs共培養(yǎng)后的HSCs組僅IGF-1(1.30±0.15)表達(dá)較HSCs單獨培養(yǎng)組(0.98±0.10)增加,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.012,0.05)；OECs共培養(yǎng)后的HSCs組NGF(0.72±0.13)表達(dá)較HSCs單獨培養(yǎng)組(1.23±0.19)減少,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.01,0.05)。 [結(jié)論] 1、OECs和SCs明顯促進(jìn)BMSCs、HSCs及NSCs的增殖和存活,且SCs對BMSCs、HSCs的影響較OECs更明顯；而SCs、OECs對NSCs的影響各異,SCs對NSCs神經(jīng)球大小的影響較OECs明顯,對NSCs增殖和活力的影響較OECs弱。 2、OECs和SCs均明顯促進(jìn)BMSCs、HSCs及NSCs的分化,且SCs和OECs明顯促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元方向分化,基本上不向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化；SCs和OECs對HSCs向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞方向分化都有明顯促進(jìn)作用,且各分化趨勢間無明顯差異；SCs和OECs明顯促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化,而明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,且SCs對NSCs向神經(jīng)元方向分化的影響較OECs更明顯,但SCs和OECs對NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的影響無明顯差異。 3、SCs抑制了BMSCs表達(dá)TrkA, OECs促進(jìn)了BMSCs表達(dá)TrkB增加；OECs、SCs均抑制了NSCs表達(dá)BDNF、NGF、PDGF、TrkB, OECs亦抑制了NSCs表達(dá)VEGF,而SCs促進(jìn)了NSCs表達(dá)TrkC增加；SCs促進(jìn)了HSCs表達(dá)BDNF、CNTF、PDGF、TGF-βl、TGF-β2、VEGF、TrkB、TrkC增加,而OECs促進(jìn)了HSCs表達(dá)IGF-1增加,抑制了HSCs表達(dá)NGF。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1581399