本文選題：糖基　切入點(diǎn)：及其　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本論文分為兩部分,第一部分研究了FcαR的糖基化對其與IgA結(jié)合的影響；第二部分研究了FcαR異形體的表達(dá)及定位。 第一部分 FcαR (CD89)是IgA的Fc受體,在IgA介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。FcαR是一個(gè)糖基化程度較高的蛋白質(zhì),它擁有六個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,FcαR的異常糖基化與HIV感染、酒精性肝硬化和IgA腎病等疾病相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)檢測了N-糖基化對FcαR與IgA結(jié)合所發(fā)揮的作用。我們發(fā)現(xiàn)將穩(wěn)定表達(dá)FcαR的CHO細(xì)胞用衣霉素進(jìn)行去N-糖基化處理后,其與IgA的結(jié)合明顯增強(qiáng)。為了明確FcαR引起與IgA結(jié)合增強(qiáng)的N-糖基化位點(diǎn),我們利用點(diǎn)突變的方法分別把六個(gè)N-糖基化位點(diǎn)的天門冬酰胺(N)替換成谷氨酰胺(Q)。流式細(xì)胞分析顯示N44、N120、N156、N165、N177位點(diǎn)去除糖基化不影響FcαR與IgA的結(jié)合,但是N58位點(diǎn)去除糖基化導(dǎo)致與IgA的結(jié)合顯著增加。相似的結(jié)果也表現(xiàn)在穩(wěn)定表達(dá)N58Q-FcαR的RBL2H3細(xì)胞(大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞系)。除此以外,我們還發(fā)現(xiàn)FcαR經(jīng)神經(jīng)氨酸酶處理去除唾液酸后,其與IgA的結(jié)合也明顯增強(qiáng),而N58正是這一現(xiàn)象中起關(guān)鍵作用的位點(diǎn)。綜上所述,我們的結(jié)果證明了N58位點(diǎn)的糖基化狀態(tài)影響了FcαR與IgA的結(jié)合。 第二部分 FcαR(本文代號為A1)是IgA的Fc受體,它在IgA介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。以前的研究證實(shí),在人的髓系細(xì)胞可以檢測到△66EC2 fcαr(代號為A2)和△EC2 fcαr(代號為A3)的轉(zhuǎn)錄物,即EC2結(jié)構(gòu)域近膜端缺失66個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物和缺失完整的免疫球蛋白樣EC2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄物。我們的實(shí)驗(yàn)主要研究了FcαR異形體(A2和A3)在CHO細(xì)胞、COS7細(xì)胞和RBL2H3細(xì)胞的表達(dá)和定位。與A1不同的是,A2和A3都不能在細(xì)胞表面表達(dá)。為了進(jìn)一步探討FcαR的胞外區(qū)影響其在細(xì)胞表面表達(dá)的氨基酸性質(zhì),我們構(gòu)建了多種FcαR的缺失突變體和置換突變體。結(jié)果顯示除第216位的蘇氨酸以外,其余的FcαR缺失突變體均不能表達(dá)在細(xì)胞表面或者受體表達(dá)量明顯降低。然而,將FcαR胞外區(qū)的一些氨基酸突變成丙氨酸,置換后的FcαR都能表達(dá)在細(xì)胞膜上另外,我們用Western Blot也沒有檢測到轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞的A2、A3蛋白條帶。這一現(xiàn)象很有可能是由于A2和A3胞外區(qū)存在部分氨基酸的缺失,致使其三維結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。因此,FcαR的EC2胞外區(qū)對維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和功能性發(fā)揮重要的作用。
[Abstract]:This thesis is divided into two parts: the first part studies the effect of FC 偽 R glycosylation on the binding of FC 偽 R to IgA, and the second part studies the expression and localization of FC 偽 R heteromorphism. Part one. FC 偽 R (CD89) is a FC receptor of IgA, which plays an important role in IgA mediated immune response. FC 偽 R is a highly glycosylated protein with six potential N-glycosylation sites. Abnormal glycosylation of FC 偽 R and HIV infection have been reported. The effects of N-glycosylation on the binding of FC 偽 R to IgA were studied. We found that CHO cells stably expressing FC 偽 R were treated with methionine to remove N-glycosylation. In order to clarify the N-glycosylation sites induced by FC 偽 R binding to IgA, By using point mutation method, the asparagine N of six N-glycosylation sites was replaced with glutamine QN. Flow cytometry analysis showed that the removal of glycosylation at the N156N165N177 site did not affect the binding of FC 偽 R to IgA, and flow cytometry (FCM) analysis showed that the glycosylation of six N-glycosylated sites at N156N165N177 site did not affect the binding of FC 偽 R to IgA. However, the removal of glycosylation at N58 site resulted in a significant increase in binding to IgA. Similar results were found in RBL2H3 cells that stably expressed N58Q-FC 偽 R (rat basophilic leukemia cell line). We also found that when FC 偽 R was treated with neuraminidase to remove sialic acid, the binding of FC 偽 R to IgA was significantly enhanced, and N58 was the key site in this phenomenon. Our results show that the glycosylation state of N58 affects the binding of FC 偽 R to IgA. Part two. FC 偽 R (codenamed A1) is the FC receptor of IgA, which plays an important role in the immune response mediated by IgA. Previous studies have confirmed that 66EC2 FC 偽 rand EC2 FC 偽 r (codenamed A2) and EC2 FC 偽 r (codenamed A3) can be detected in human myeloid cells. That is, the transcripts of 66 nucleotides and complete immunoglobulin-like EC2 domains are missing from the proximal end of the EC2 domain. Our experiment mainly studied the expression of FC 偽 R heteromorphism A _ 2 and A _ 3) in the CHO cells of COS7 cells and RBL2H3 cells. Different from A1, neither A _ 2 nor A _ 3 could be expressed on the cell surface. In order to further study the effect of extracellular domain of FC 偽 R on the amino acid properties of FC 偽 R, We constructed a variety of FC 偽 R deletion mutants and replacement mutants. The results showed that none of the FC 偽 R deletion mutants could express on the cell surface or the receptor expression level was significantly decreased except for the 216th position threonine. Some amino acids in the extracellular domain of FC 偽 R were mutated into alanine. We also did not detect the A2A3 protein band transfected to CHO cells by Western Blot. This phenomenon is probably due to the deletion of some amino acids in the extracellular domain of A2 and A3. Therefore, the extracellular domain of FC 偽 R plays an important role in maintaining the stability and functionality of protein structure.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1580992