本文選題：B-H　切入點(diǎn)：胞外區(qū)　出處：《細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志》2016年09期 　論文類(lèi)型：期刊論文

【摘要】：目的構(gòu)建小鼠抗B7-H4胞外區(qū)核糖體展示單鏈抗體(sc Fv)庫(kù),并篩選出特異性高的抗體。方法從A549細(xì)胞的c DNA中擴(kuò)增B7-H4胞外區(qū)基因,將其插入原核表達(dá)載體p ET-28 a(+)中表達(dá),獲得B7-H4胞外區(qū)重組蛋白后純化并免疫BALB/c小鼠。從免疫小鼠脾臟中提取總RNA,并利用反轉(zhuǎn)錄PCR、重疊延伸PCR(SOE-PCR)等技術(shù)擴(kuò)增出重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(Vκ)、VH接頭(VH-linker)序列和Vκ接頭(Vκ-linker)序列,得到重輕鏈可變區(qū)基因的連接產(chǎn)物VH/Vκ。VH/Vκ與p UM19-T載體連接并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)菌株中,利用菌落PCR技術(shù)鑒定并測(cè)序。使用TNT溲T7 Quick for PCR DNA試劑盒對(duì)構(gòu)建出的抗體庫(kù)進(jìn)行體外翻譯與篩選,采用Western blot法和間接ELISA對(duì)得到的抗體進(jìn)行特異性鑒定。結(jié)果經(jīng)生物公司測(cè)序分析,得到序列正確的重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(Vκ)及二者連接產(chǎn)物(VH/Vκ),大小分別為439 bp、680 bp及1098 bp。經(jīng)特異性實(shí)驗(yàn)分析,從得到的抗體庫(kù)中篩選出的抗體與B7-H4具有高特異性結(jié)合能力。結(jié)論成功構(gòu)建出鼠抗B7-H4胞外區(qū)核糖體展示sc Fv庫(kù),并篩選出與B7-H4胞外區(qū)重組蛋白高特異性結(jié)合的目標(biāo)sc Fv。
[Abstract]:Objective to construct mouse anti-B7-H4 single chain antibody (scFv) library and to screen specific antibody. Methods B7-H4 extracellular domain gene was amplified from c DNA of A549 cell line and inserted into prokaryotic expression vector p ET-28 a (). B7-H4 extracellular domain recombinant protein was obtained and purified and immunized into BALB/c mice. Total RNAs were extracted from the spleen of immunized mice. The heavy chain variable region (VHN), the light chain variable region (VH) and the V 魏 V 魏 -linker (V 魏 -linker) sequence were amplified by reverse transcription and overlapping extension of PCR- SOE-PCR. The ligation product of heavy light chain variable region gene, VH/V 魏. VH / V 魏, was ligated with p UM19-T vector and transformed into E. coli DH5 偽 competent strain. The antibody library was identified and sequenced by colony PCR technique. The constructed antibody library was translated and screened in vitro using TNT Deutzia T7 Quick for PCR DNA kit. The antibody was identified by Western blot and indirect ELISA. The correct sequence of heavy chain variable region (VH), light chain variable region (V 魏) and their conjugate products (439 BP 680bp) and 1098 BP (1098 BP) were obtained. Conclusion the mouse anti-B7-H4 extracellular ribosomal display sc Fv library was successfully constructed, and the target sc Fv was screened for binding to B7-H4 extracellular domain recombinant protein.
【作者單位】： 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;江蘇省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：江蘇省教育廳自然科學(xué)基金(08KJD35002)
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1581072