本文關(guān)鍵詞： 脂肪基質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 Wnt信號通路 Wnt3a 多巴胺能神經(jīng)元 酪氨酸羥化酶　出處：《河北聯(lián)合大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的: 通過觀察脂肪組織來源的基質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)向多巴胺能神經(jīng)元分化過程中的wnt3a蛋白的表達(dá)變化,探討Wnt3a在定向誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化過程中的作用,進(jìn)一步研究wnt信號通路對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響,從而為臨床細(xì)胞移植治療技術(shù)提供新的細(xì)胞來源及細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。 方法: 1.脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng) 無菌條件下取2～4周SD大鼠腹股溝脂肪,脂肪基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照Zuk PA的方法進(jìn)行,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng),并換液傳代。倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察原代及傳代后的細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化,并照相記錄。 2.脂肪源性基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化 將第三代的ADSCs采用胰酶消化,傳第四代細(xì)胞至已預(yù)先放入無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,制備細(xì)胞爬片,至細(xì)胞長成80%融合時,去除培養(yǎng)液,加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。實驗分為5組進(jìn)行,分別為: A組為神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NIM)誘導(dǎo)8小時組,B組為NIM誘導(dǎo)16小時組,C組為NIM誘導(dǎo)24小時組,D組為NIM誘導(dǎo)32小時組;對照組為普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化,并照相記錄。 3.神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志和神經(jīng)遞質(zhì)合成過程中關(guān)鍵酶的檢測 于各規(guī)定時間點采用免疫組化法和間接免疫熒光法檢測神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志神經(jīng)巢蛋白(Nestin),神經(jīng)細(xì)胞的特異性標(biāo)志神經(jīng)特異神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、微管聯(lián)合蛋白2(MAP2)和多巴胺合成過程中的關(guān)鍵酶酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)情況。 4. Nurr1、TH、Wnt3a蛋白的Real Time-PCR檢測 采用Trizol一步法提取誘導(dǎo)后細(xì)胞總RNA,紫外分光光度儀測定RNA的A260/A280值。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從總RNA中的mRNA獲得cDNA,再經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)基因:多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性標(biāo)志Nurr1、多巴胺合成過程中的關(guān)鍵酶酪氨酸羥化酶TH和Wnt信號通路起始蛋白Wnt3a的表達(dá)情況。PCR總反應(yīng)體系為10μl,反應(yīng)條件為:94℃20sec,53℃20sec,60℃40sec,40cycles。熒光曲線結(jié)果應(yīng)用Rotor—Gene 3000實時熒光PCR儀的Comparative Delta-delta CT法進(jìn)行分析,每一組應(yīng)用六個樣本檢測其基因表達(dá)結(jié)果。 5.對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行HE染色以觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)。 6.統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)在錄入前進(jìn)行嚴(yán)格的校對,以Excel數(shù)據(jù)庫整理后采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。同一組內(nèi)不同時間點間均數(shù)的比較采用單因素方差分析,以p0.05為差異在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性意義。采用Microsoft Excel軟件作圖。 結(jié)果: 1.原代和傳代細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化 原代細(xì)胞剛接種后在倒置顯微鏡下觀察,呈圓形亮點,可見大量油滴及少量結(jié)締組織纖維,4小時左右即有少量細(xì)胞貼壁,24小時首次換液后觀察,未貼壁細(xì)胞及雜質(zhì)細(xì)胞被去除掉,大量成活細(xì)胞貼壁,貼壁細(xì)胞呈三角形、多角形、類圓形或類梭形,并逐漸開始伸展、分裂、呈梭形或多角形,3～5 d迅速增殖,5～7 d后細(xì)胞呈集落生長,集落大小不一,含數(shù)十個至數(shù)百個細(xì)胞不等,并含有少量圓形或卵圓形細(xì)胞混雜生長。 傳代細(xì)胞初始形態(tài)呈圓形,懸浮狀態(tài),并很快貼壁,剛貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形或類圓形,3～4小時后所有成活細(xì)胞完全貼壁,均勻分布,與原代細(xì)胞相比,細(xì)胞形態(tài)更為單一,呈梭形,且增殖速度明顯加快,出現(xiàn)多個漩渦狀生長區(qū), 4～5天即長滿瓶底。 2.誘導(dǎo)后細(xì)胞生長情況和形態(tài)變化 加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基1～2小時內(nèi),各組細(xì)胞形態(tài)即發(fā)生顯著變化。細(xì)胞體積縮小,胞質(zhì)以胞核為中心收縮并向兩側(cè)延長,細(xì)胞體逐漸形成球形并形成突起,立體感增強(qiáng),折光性增加。隨著時間進(jìn)展,經(jīng)NIM誘導(dǎo)后,ADSCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞,在一定的時間內(nèi),分化的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)逐漸增加,形成雙極或多極細(xì)胞,細(xì)胞突起互相交織成網(wǎng)。 3.神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志和神經(jīng)遞質(zhì)合成過程中關(guān)鍵酶的表達(dá) (1)誘導(dǎo)分化完成后,對照組未發(fā)現(xiàn)Nestin的陽性表達(dá),其余各組均有Nestin的陽性表達(dá),且以D組最高,A、B、C、D組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 (2)誘導(dǎo)分化完成后,對照組未發(fā)現(xiàn)NSE的陽性表達(dá),其余各組均有NSE的陽性表達(dá),且以D組表達(dá)最高,A、B、C、D組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05) (3)誘導(dǎo)分化完成后,對照組未發(fā)現(xiàn)MAP2的陽性表達(dá),其余各組均有MAP2的陽性表達(dá),且以D組表達(dá)最高, A、B、C、D組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 (4)誘導(dǎo)分化完成后,對照組未發(fā)現(xiàn)TH陽性表達(dá),其余各組均有TH的陽性表達(dá),且以D組表達(dá)最高,A、B、C、D組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 (5)間接免疫熒光檢測結(jié)果,除對照組外,其余各組均有TH表達(dá)。 4. HE染色結(jié)果誘導(dǎo)后的ADSCs經(jīng)HE染色可見典型的雙極或多極細(xì)胞,中間可見藍(lán)色的細(xì)胞核,胞漿及突起為紅色。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)典型神經(jīng)元樣改變。 5. Real Time-PCR檢測Nurr1、TH和Wnt3a的表達(dá) ADSCs誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的Nurr1、TH、Wnt3a基因mRNA的表達(dá)結(jié)果:應(yīng)用NIM誘導(dǎo)劑對ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo),在誘導(dǎo)后相同基因的mRNA在不同組間的平均相對濃度比較,差異均具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。對Wnt3a、TH、Nurr1 PCR結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,Wnt3a分別與TH、Nurr1變化一致,呈正相關(guān)(p0.05 rTH=0.957,rNurr1=0.979)。 結(jié)論: 1.經(jīng)NIM誘導(dǎo),ADSCs可分化為多巴胺能神經(jīng)元,各組分化為的神經(jīng)細(xì)胞陽性率比較,D組最高,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p 0.05)。 2. Real Time-PCR技術(shù)檢測,除對照組外,其余各組均有Nurr1、TH和Wnt3a mRNA的表達(dá),且各標(biāo)志物均以D組表達(dá)最高,各標(biāo)志物組間比較,差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p 0.05)。 3. Wnt3a可能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分化,分化后的細(xì)胞能表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329.28

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1528970