本文關(guān)鍵詞： 白念珠菌 脂筏 Rta2p 咪康唑　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：白念珠菌（Candida albicans）是目前深部真菌感染最為普遍的病原菌之一，目前治療白念珠菌感染臨床應(yīng)用較多的是唑類藥物，隨著長(zhǎng)期大量廣泛地應(yīng)用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生，由耐藥導(dǎo)致的治療失敗越來(lái)越多。因此，需要我們尋找白念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制，為藥物治療提供依據(jù)。在白念珠菌中，，脂筏（lipid rafts）也叫做去垢劑不溶膜（detergent-resistant membranes, DRMs），是細(xì)胞膜上富含麥角甾醇和鞘脂的區(qū)域，其中還包含許多具有重要功能的蛋白，在許多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在白念珠菌中，RTA2是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的唑類藥物耐藥的必須基因，并且Rta2p參與了鞘脂成分—長(zhǎng)鏈堿二氫鞘氨醇從細(xì)胞膜內(nèi)向細(xì)胞膜外轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，我們推測(cè)Rta2p可能是通過(guò)影響脂筏發(fā)揮對(duì)唑類藥物的耐藥作用。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了Rta2p-GFP的融合表達(dá)菌，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)Rta2p可以和脂筏的主要組成成分麥角甾醇共定位，且這種定位會(huì)被麥角甾醇和鞘脂合成通路的抑制劑破壞。接著我們用加入去垢劑TritonX-100的密度梯度超速離心方法提取脂筏，利用Western blot方法考察分離的脂筏，發(fā)現(xiàn)Rta2p與公認(rèn)的脂筏的標(biāo)志性蛋白（Pma1p and Gas1p同源蛋白）都定位在脂筏區(qū)域，而這種定位也會(huì)被麥角甾醇和鞘脂合成通路的抑制劑破壞。為了研究RTA2缺失對(duì)脂筏的影響，我們首先通過(guò)氣－質(zhì)聯(lián)用的方法測(cè)定了親本菌，缺失菌的總甾醇含量，及脂筏區(qū)，非筏區(qū)麥角甾醇的百分含量，用Filipin染色觀察麥角甾醇分布，結(jié)果顯示，兩株菌之間都沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明RTA2缺失并不影響麥角甾醇的總含量，在脂筏區(qū)的含量和分布。我們又用蛋白質(zhì)組學(xué)和Western blot方法發(fā)現(xiàn)Rta2p主要影響10個(gè)脂筏區(qū)域蛋白在脂筏區(qū)域的分布。其中，有5個(gè)蛋白(Pma1p, Gas1p同源蛋白, Erg11p, Pmt2p和Ali1p)已經(jīng)被報(bào)道存在于脂筏區(qū)域，而且其中的Erg11p還是白念珠菌中眾所周知的唑類藥物的靶蛋白�？偠灾覀兊慕Y(jié)果說(shuō)明Rta2p主要定位在脂筏區(qū)域，而且會(huì)影響脂筏區(qū)域某些特定蛋白的錨定，其在脂筏分布還會(huì)被麥角甾醇和鞘脂合成通路的抑制劑破壞。 不同于常見(jiàn)的唑類藥物的作用機(jī)制，咪康唑除了能夠抑制麥角甾醇合成通路外，還能誘導(dǎo)活性氧(ROS)3在細(xì)胞內(nèi)累積，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡，在這之前，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的聚集。有研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中，脂筏在咪康唑發(fā)揮抗真菌活性的過(guò)程中十分重要。我們想要考察在白念珠菌中是否有相同的機(jī)制，以及RTA2缺失是否會(huì)影響咪康唑的抗真菌活性。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過(guò)點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)（Spot assay）發(fā)現(xiàn)，在白念珠菌中RTA2缺失不會(huì)影響白念珠菌對(duì)咪康唑的敏感性。接著我們?cè)谝吧桶啄钪榫锌疾熘ひ种苿⿲?duì)（1）測(cè)定咪康唑抗真菌活性（2）咪康唑誘導(dǎo)的活性氧累積量（3）咪康唑誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚集的影響，發(fā)現(xiàn)用麥角甾醇或者鞘脂合成通路抑制劑（甲基β環(huán)糊精或依地福新）破壞脂筏會(huì)抵抗咪康唑的抗真菌活性，以及其誘導(dǎo)的活性氧累積和肌動(dòng)蛋白聚集。為了探索Rta2p是否參與了咪康唑這一抗真菌活性機(jī)制，我們同時(shí)對(duì)RTA2缺失菌(rta2Δ/Δ)做了與野生菌相同的實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)在單用咪康唑的情況下，RTA2缺失菌和親本菌的生存率，活性氧累積量以及肌動(dòng)蛋白聚集情況都沒(méi)有顯著差別。但在同時(shí)加入脂筏抑制劑（甲基β環(huán)糊精或依地福新）后，RTA2缺失能夠與脂筏抑制劑協(xié)同抑制咪康唑發(fā)揮抗真菌作用。綜上所述，Rta2p是一個(gè)脂筏區(qū)蛋白，能夠通過(guò)影響某些脂筏區(qū)蛋白分布發(fā)揮作用。還能與脂筏抑制劑協(xié)同抑制咪康唑發(fā)揮抗真菌活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R379

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周潔;廖萬(wàn)清;;真菌生物膜形成及應(yīng)對(duì)策略[J];世界臨床藥物;2011年07期

2 祝賀;王文嶺;李海濤;敖俊紅;楊蓉婭;;不同來(lái)源阿薩希毛孢子菌菌絲相體外誘導(dǎo)條件的探討[J];實(shí)用皮膚病學(xué)雜志;2011年02期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 閻瀾;李妙海;曹永兵;高平揮;王彥;姜遠(yuǎn)英;;白念珠菌耐藥新蛋白——交替氧化酶[A];藥學(xué)發(fā)展前沿論壇及藥理學(xué)博士論壇論文集[C];2008年

2 徐永豪;李春陽(yáng);;耐氟康唑白念珠菌所致外陰陰道念珠菌病1例[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第14次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

3 陳興;侯天文;白云;李瑋;陳晶;郭曉麗;劉艷麗;;住院患者念珠菌菌尿的調(diào)查[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)成立30周年慶典大會(huì)資料匯編[C];2009年

4 張欣;蘇雯靜;李巍;安金剛;劉玉峰;;單克隆天然抗體3B4抑制白念珠菌芽管形成的機(jī)制初探[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

5 郭仁勇;;白念珠菌聚苯乙烯黏附增強(qiáng)基因1的研究進(jìn)展[A];2008年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

6 劉澤虎;呂雪蓮;呂桂霞;沈永年;徐宏彬;陳偉;胡素泉;劉維達(dá);;煙曲霉選擇性培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)研究[A];2008全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

7 賈鑫明;曹永兵;王彥;姜遠(yuǎn)英;;白念珠菌RTA2是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路介導(dǎo)的耐藥性產(chǎn)生的靶基因[A];藥學(xué)發(fā)展前沿論壇及藥理學(xué)博士論壇論文集[C];2008年

8 陳官芝;馬海麗;;念珠菌黏附特性對(duì)比研究[A];2007中華醫(yī)學(xué)會(huì)第二次醫(yī)學(xué)真菌學(xué)術(shù)會(huì)議暨醫(yī)學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室研究技術(shù)新進(jìn)展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

9 秦曉峰;吳建華;黃懿;張麗娟;姜遠(yuǎn)英;顧軍;;微量稀釋法測(cè)定白念珠菌對(duì)氟康唑的MIC值及兩種藥敏試驗(yàn)的比較[A];2008全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

10 楊繼君;陳興平;;白念珠菌生物膜形成不同時(shí)期對(duì)氟康唑敏感性的初步研究[A];“環(huán)境與健康”學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 鄒先彪;白念珠菌感染的預(yù)警[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

2 中國(guó)醫(yī)科院皮膚病研究所教授 吳紹熙;從誤診病例談臨床思維[N];健康報(bào);2007年

3 健康時(shí)報(bào)實(shí)習(xí)記者　 梁璐;瘙癢部位不同用藥有別[N];健康時(shí)報(bào);2006年

4 范高明;艾格生蛋黃免疫球蛋白 筑起國(guó)民免疫新長(zhǎng)城[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

5 丁潔 傳寶;太鋼成功研發(fā)新型抗菌不銹鋼[N];太原日?qǐng)?bào);2006年

6 記者 陳強(qiáng) 通訊員 蔣淑芬 賈寧;太鋼成功研發(fā)出新型抗菌不銹鋼[N];中國(guó)冶金報(bào);2006年

7 記者　齊作權(quán) 通訊員　黃傳寶;永恒抗菌不銹鋼在太鋼問(wèn)世[N];山西日?qǐng)?bào);2006年

8 記者衣曉峰 靳萬(wàn)慶 通訊員莊磊;臨床研究證實(shí)甲真菌病病原菌種發(fā)生變遷[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

9 本報(bào)記者 包斯文;經(jīng)濟(jì)新穎和抗菌型不銹鋼市場(chǎng)前景廣闊[N];中國(guó)冶金報(bào);2004年

10 ;抗菌不銹鋼在沈陽(yáng)研制成功[N];今日信息報(bào);2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王琳;白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白R(shí)ta2p與脂筏關(guān)系研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

2 許懿;小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌的作用機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

3 曹永兵;轉(zhuǎn)錄因子Caplp促進(jìn)白念珠菌抗藥性形成的分子機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 焦?jié)升?重組Sap2蛋白接種對(duì)免疫抑制小鼠系統(tǒng)感染白念珠菌的保護(hù)作用[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2011年

5 劉偉;白念珠菌CaSCH9基因功能研究[D];天津大學(xué);2010年

6 吳建華;白念珠菌細(xì)胞周期及抗真菌中藥單體對(duì)其影響的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

7 賀志彬;白念珠菌耐藥基因CDR1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 陳臘梅;攜帶G487T和T916C突變的白念珠菌耐藥基因表達(dá)與氟康唑耐藥關(guān)系的研究[D];山東大學(xué);2010年

9 陳孫孝;白念珠菌鈣調(diào)蛋白基因(CMD1)缺陷菌株的構(gòu)建及CMD1功能性基因的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

10 王惠平;應(yīng)用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)白念珠菌耐氟康唑相關(guān)基因點(diǎn)突變的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張石群;白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白R(shí)ta2p生物活性位點(diǎn)的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

2 劉朝紅;漢防己甲素對(duì)氟康唑抗白念珠菌生物膜增效活性的初步研究[D];暨南大學(xué);2010年

3 鐘毅;白念珠菌蘋(píng)果酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)及功能初步研究[D];中山大學(xué);2012年

4 張蕾;紫外線對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2012年

5 陳文峰;雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑體外抗白念珠菌活性的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

6 董玲玲;生物被膜型白念珠菌代謝物分析及代謝變化的初步研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

7 黃悅;白念珠菌HOG基因致病相關(guān)性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

8 仇萌;白念珠菌Sap2快速檢測(cè)方法的建立[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2012年

9 張玉倩;BDSF抑制白念珠菌生物膜的形成[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

10 關(guān)小凡;白念珠菌靜脈感染對(duì)脾虛小鼠致病性的研究[D];遼寧中醫(yī)學(xué)院;2003年

本文編號(hào)：1528710