本文關(guān)鍵詞： 脂筏 細胞入侵 丙型肝炎病毒 日本腦炎病毒 腸道病毒71型　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：細胞膜中有一類特殊的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，富含膽固醇和磷鞘脂，在細胞膜上呈島狀分布，如漂浮在甘油磷脂海洋上的木筏，因此被稱為“脂筏”（lipid raft）。脂筏是細胞進行多種生命活動的活躍區(qū)域，通過為蛋白質(zhì)的相互作用提供募集平臺，在跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運輸分選、細胞骨架重建等過程中都發(fā)揮重要的作用。 作為病毒感染的首要環(huán)節(jié)，入侵在病毒整個生活周期中具有舉足輕重的作用，也是抗病毒研究策略的重要靶標(biāo)。病毒入侵宿主細胞必須經(jīng)過以下幾個步驟：（1）吸附到宿主細胞表面，（2）穿入細胞質(zhì)或內(nèi)含體，（3）脫殼。病毒為了完成從胞外到胞內(nèi)的穿膜過程，往往利用宿主細胞膜上的某些結(jié)構(gòu)域或微環(huán)境。目前研究證實，作為細胞膜的重要組成部分，脂筏是病毒與宿主細胞相互作用的活躍區(qū)域。 脂筏調(diào)節(jié)包膜病毒細胞入侵的機制大致有四種：（1）病毒包膜蛋白錨固于脂筏中；（2）病毒受體為脂筏定位；（3）基于脂筏的病毒包膜蛋白構(gòu)象變化或膜融合；（4）脂筏依賴的病毒內(nèi)吞。人免疫缺陷病毒（HIV）是一個研究得較清楚、被歸為脂筏病毒的包膜病毒：HIV包膜蛋白gpl20與脂筏中的膽固醇結(jié)合，其受體CD4及輔助受體CCR5均為脂筏蛋白；一些靶向脂筏的化合物也顯現(xiàn)出很強的抗HIV活性，提示了以脂筏作為抗病毒藥物靶點的可能性。然而，不同的包膜病毒識別不同的受體，膜融合觸發(fā)機制又有pH依賴和非依賴之分，因此包膜病毒利用脂筏完成有效入侵的方式也各不相同。了解脂筏在病毒細胞入侵中的作用環(huán)節(jié)，可針對性地設(shè)計和研發(fā)抗病毒藥物。 相對于包膜病毒膜融合觸發(fā)機制的深入研究，非包膜病毒的細胞入侵機制知之甚少。目前研究發(fā)現(xiàn)，有些非包膜病毒通過脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進入靶細胞，比如腸道病毒1型（Echovirus1，EV1）、猿猴病毒40（Simian Virus40，SV40）等；有些則通過與定位在脂筏上的受體結(jié)合而啟動病毒入侵，如：柯薩奇病毒（Coxsackieviruses）、輪狀病毒（Rotavirus）等。因此，探索脂筏調(diào)控病毒感染的膜上事件，有利于進一步闡明病毒細胞入侵的分子機制。 細胞膜是阻斷病毒感染靶細胞的第一道屏障。本課題從細胞膜脂筏入手，以三種單正鏈RNA病毒為研究對象，包括有包膜的丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒以及無包膜的腸道病毒71型，研究脂筏調(diào)節(jié)病毒與宿主細胞相互作用的分子機制，探討不同病毒利用脂筏完成細胞入侵的區(qū)別與聯(lián)系。 一、脂筏影響丙型肝炎病毒細胞入侵的機制研究 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)屬于黃病毒科、丙型肝炎病毒屬，為有包膜的單正鏈RNA病毒。其包膜蛋白E1和E2存在于病毒顆粒的表面，是介導(dǎo)病毒吸附和進入宿主細胞的關(guān)鍵蛋白。隨著HCV體外感染模型HCVpp和HCVcc系統(tǒng)的建立與完善，已經(jīng)鑒定出了HCV的四個必需受體：四次跨膜蛋白CD81、B族I型清道夫受體（SR-BI）、以及緊密連接分子claudin-1（CLDN1）和occludin（OCLN）。其中，CD81是最先被鑒定出的受體，其胞外大環(huán)能夠直接與HCV E2蛋白結(jié)合；結(jié)合后激活相關(guān)信號通路，引起細胞骨架肌動蛋白重建，介導(dǎo)病毒體向緊密連接處移動，并與共受體CLDN1相互作用，在后者幫助下完成內(nèi)吞�，F(xiàn)有研究表明，HCV細胞入侵過程依賴于細胞膜上完整的脂筏結(jié)構(gòu)，然而其機制尚不清楚。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在HCV入侵過程中，CD81分布于細胞膜脂筏中；而膽固醇刪除后改變CD81分布模式，使其定位于非脂筏區(qū)域，提示CD81脂筏分布可能為HCV細胞入侵所必需。為進一步分析CD81脂筏定位的重要作用，本實驗分別構(gòu)建了CD81脂筏定位和非脂筏定位的突變體真核表達質(zhì)粒。這些突變體保留了CD81與HCV E2相互作用的胞外大環(huán)，而將其跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)置換為脂筏蛋白（SR-BI和CD9）或非脂筏蛋白（CD71）的相應(yīng)結(jié)構(gòu)。繼而將質(zhì)粒（野生型wtCD81、CD9-81LEL、SRBI-81LEL和CD71-81LEL）轉(zhuǎn)染CD81缺陷的Huh7細胞（Huh7CD81-細胞），應(yīng)用流式細胞術(shù)證明，置換胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)不影響CD81分子的膜上表達和空間構(gòu)象。通過蔗糖密度梯度超速離心分離靶細胞脂筏后發(fā)現(xiàn)，wtCD81、CD9-81LEL、SRBI-81LEL定位在脂筏中，而CD71-81LEL為非脂筏定位，提示CD81跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)具有脂筏定位功能。利用HCV體外感染模型HCVpp和HCVcc系統(tǒng)，比較各CD81突變體介導(dǎo)HCV細胞入侵以及感染的能力。結(jié)果顯示，除非脂筏定位的CD71-81LEL外，其余脂筏定位的CD81突變體均能有效支持HCV細胞入侵。在此基礎(chǔ)上，我們通過觀察比較不同脂筏定位的CD81分子在病毒結(jié)合、GTPase Rho信號通路激活、細胞骨架肌動蛋白重建、介導(dǎo)病毒向細胞緊密連接處遷移并形成HCV-CD81-CLDN1等功能的影響，分析細胞膜脂筏參與HCV細胞入侵過程的分子機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非脂筏定位的CD71-81LEL突變體結(jié)合病毒的能力并未改變，但卻不能介導(dǎo)HCV與共受體CLDN1相互作用。進一步通過Western blotting和激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn)，CD71-81LEL不能介導(dǎo)HCV感染的機制是由于其定位在非脂筏區(qū)域無法激活GTPase Rho信號通路，引起細胞骨架肌動蛋白重建所致。 二、脂筏對日本腦炎病毒細胞入侵的影響及其機制研究 日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）又稱流行性乙型腦炎病毒，屬于黃病毒屬（Flavivirus），和HCV一樣同為黃病毒科成員，是有包膜的單股正鏈RNA病毒。有文獻報道，細胞膜脂筏在JEV細胞入侵以及復(fù)制周期中扮演了重要角色，但其作用機制仍需進一步研究�？紤]到病毒受體在病毒與脂筏相互作用中的樞紐功能，本研究將人肝癌細胞株Huh7細胞為研究對象，以JEV為感染材料，分析熱休克蛋白70（HSP70）作為JEV受體在介導(dǎo)病毒細胞入中侵的作用，并通過觀察HSP70脂筏定位對于JEV感染性的影響，探討脂筏參與JEV入侵的分子機制。 本研究通過一系列功能性實驗，觀察HSP70是否為JEV感染Huh7細胞所必需。首先，在病毒感染前將HSP70多克隆抗體預(yù)先與Huh7細胞孵育，JEV感染24h后，用間接免疫熒光染色檢測JEV E蛋白表達，同時用空斑實驗對細胞上清中的病毒進行定量。結(jié)果顯示，HSP70多克隆抗體可顯著抑制JEV E蛋白表達，并且這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性。空斑實驗結(jié)果得出同樣的結(jié)論：隨著抗體濃度的增加，細胞上清中JEV感染滴度逐漸下降；在加入10μg/ml濃度抗體時，病毒滴度下降了100倍。其次，作為病毒受體必需在細胞膜表面表達，流式細胞術(shù)結(jié)果證明HSP70確實存在于Huh7細胞表面。接著，將病毒與Huh7細胞于4℃共同孵育，通過免疫沉淀HSP70，觀察沉淀復(fù)合物中是否存在JEV E蛋白，結(jié)果表明HSP70抗體的沉淀復(fù)合物中確實存在JEV包膜蛋白。這些結(jié)果提示，HSP70是介導(dǎo)JEV感染Huh7細胞的一個重要的細胞膜分子。HSP70家族由幾個高度保守的熱休克蛋白組成，包括HSP70、HSC70、GRP75和GRP78。由于多克隆抗體可能對HSP70家族不同的蛋白存在交叉反應(yīng)性，因此我們通過特異性的單克隆抗體來觀察參與JEV感染的熱休克蛋白究竟是HSP70家族的哪個成員。抗體抑制實驗結(jié)果顯示，在JEV感染過程中發(fā)揮作用的是HSP70，而非HSC70和GRP78。此外，我們應(yīng)用特異性siRNA的抑制實驗對上述結(jié)果加以驗證，排除了HSP70家族其他成員作為JEV感染Huh7細胞受體的可能性。 為觀察具有JEV受體功能的HSP70是否定位于脂筏中，本研究對Huh7細胞進行了脂筏分離。結(jié)果顯示，天然狀態(tài)下，少量HSP70定位于Huh7細胞的脂筏結(jié)構(gòu)中；而JEV感染后，HSP70則向細胞膜脂筏聚集，提示HSP70可被JEV招募至脂筏中。應(yīng)用膽固醇刪除劑干擾脂筏后，顯著抑制JEV細胞入侵。通過對其機制分析，發(fā)現(xiàn)干擾脂筏不影響病毒結(jié)合，但改變了HSP70的脂筏定位。因此，，我們推測脂筏刪除對JEV感染性的影響可能是由于抑制了HSP70的受體功能。一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗結(jié)果顯示，JEV感染早期會激活PI3K/Akt信號通路，并且這種激活作用是由HSP70結(jié)合JEV后引起；而刪除膽固醇后，HSP70對此通路的激活作用被抑制，提示HSP70發(fā)揮受體功能需依賴于完整的脂筏結(jié)構(gòu)。 三、脂筏對腸道病毒71型細胞入侵的影響及其機制研究 腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）是單股正鏈RNA病毒，無包膜，屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus）。EV71是引起嬰幼兒手足口病（hand-foot-mouse disease, HFMD）的主要病原體之一。目前還沒有針對EV71的特效藥物，也沒有預(yù)防性或治療性疫苗問世。EV71的衣殼蛋白VP1是EV71的主要抗原表位和分型依據(jù)，也是EV71與宿主細胞上受體分子相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。人胚橫紋肌肉瘤細胞株RD細胞是EV71的易感細胞，宿主細胞上的B族II型清道夫受體（SR-BII）為其必需受體。許多腸道病毒，比如脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）、柯薩奇病毒（Coxsackieviruses）以及�？刹《荆‥chovirus）等，在入侵靶細胞的過程中都依賴于完整的細胞膜脂筏結(jié)構(gòu)。然而，細胞膜脂筏在EV71感染過程中的作用尚未見文獻報道。 MβCD是最常見的干擾脂筏的藥物，其作用機制是特異性的刪除或驅(qū)散細胞膜上的膽固醇。Nystatin通過與膽固醇結(jié)合形成復(fù)合物而封閉脂筏，Lovastatin則能夠直接抑制細胞合成膽固醇，都被用作干擾脂筏的藥物而被廣泛應(yīng)用。本實驗將不同機制干擾脂筏的藥物預(yù)先與RD細胞孵育，然后加入病毒，通過以下三種方法分析脂筏對EV71感染性的影響：（1）在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(yīng)；（2）qRT-PCR檢測RD細胞中EV71RNA拷貝數(shù)；（3）收集細胞上清，用空斑實驗檢測病毒滴度。結(jié)果顯示，MβCD、nystatin和lovastatin均能顯著抑制EV71引起的細胞病變效應(yīng)、病毒RNA拷貝數(shù)和上清中的病毒滴度，并呈明顯的劑量依賴性。為進一步證明脂筏對于EV71感染性的影響，我們給RD細胞外源補充膽固醇。結(jié)果顯示，膽固醇加入后能夠促進靶細胞對于EV71的易感性。這些結(jié)果提示，EV71利用細胞膜脂筏感染RD細胞。 為研究脂筏在EV71細胞入侵過程中的作用機制，我們首先觀察MβCD是否影響病毒與受體的相互作用，檢測了MβCD對膜表面SR-BII表達、病毒與SR-BII相互作用、病毒與靶細胞結(jié)合以及病毒-受體脂筏定位的影響。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，MβCD作用前后RD細胞膜上SR-BII表達量無明顯差異，結(jié)合在細胞表面的膜上病毒量也沒有減少。免疫共沉淀和Western blotting結(jié)果顯示，EV71與SR-BII的相互作用不受MβCD影響。然而，脂筏分離結(jié)果表明，MβCD干擾脂筏改變了病毒與SR-BII的脂筏分布。由于EV71的內(nèi)吞是由SR-BII介導(dǎo)完成的，因此我們推測MβCD很可能影響了病毒內(nèi)吞。為觀察干擾脂筏對EV71內(nèi)吞的影響，在MβCD處理過的RD細胞中加入病毒于4℃孵育；再將細胞轉(zhuǎn)移至37℃使病毒內(nèi)吞；分別在轉(zhuǎn)移37℃后10min、30min和60min將細胞固定，進行間接免疫熒光染色和激光共聚焦掃描。結(jié)果顯示，在MβCD處理后，胞漿中檢測不到內(nèi)吞的病毒顆粒，提示干擾脂筏能夠抑制EV71的內(nèi)吞過程。 由于SR-BII并不是EV71感染RD細胞的唯一受體，還可能有其他共受體或宿主因子參與病毒入侵過程，因此脂筏調(diào)節(jié)病毒與宿主細胞相互作用的精確分子機制尚需進一步研究證明。 小結(jié) 本研究為脂筏參與HCV、JEV和EV71細胞入侵提供了直接證據(jù)，進一步闡明了這三種病毒細胞入侵的分子機制。置換CD81跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)改變其脂筏定位的方法，為研究其他受體分子在介導(dǎo)病毒入侵中的作用提供了借鑒。證明了HSP70具有作為JEV感染Huh7細胞的受體功能，并且依賴脂筏介導(dǎo)病毒入侵。闡明了非包膜病毒EV71利用脂筏完成病毒入侵及其機制。 本研究通過分析脂筏在三種RNA病毒細胞入侵的作用，找出脂筏調(diào)節(jié)病毒與宿主細胞相互作用的可能規(guī)律：作為病毒受體的蛋白質(zhì)分子在正常狀態(tài)下就集中定位于脂筏中，而另一些則是在宿主細胞接觸病原體后遷入脂筏，因此脂筏可能通過富集受體蛋白和相關(guān)分子，為病原體與靶細胞的相互作用提供平臺，是多種病毒入侵靶細胞優(yōu)先選擇的“大門”。這為以脂筏為靶點設(shè)計抗病毒藥物提供了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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