本文關(guān)鍵詞： HIV 整合酶 鏈轉(zhuǎn)移抑制劑 耐藥性 易感性 單域抗體　出處：《華東師范大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy, HAART)能夠有效地延緩HIV/AIDS患者的疾病進(jìn)程,改善其生存狀況。但由于耐藥性病毒的不斷出現(xiàn)以及HIV潛伏池(latent reservoir)等多種原因,抗逆轉(zhuǎn)錄病毒新藥的開發(fā)始終受到極大的重視。首個(gè)整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑(integrase strand transfer inhibitor, INSTI), raltegravir (RAL),于2007年十月由美國(guó)食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)上市,其療效足以同已上市的任何抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物相媲美,因而從實(shí)踐上驗(yàn)證了整合酶是一個(gè)極好的抗病毒治療靶點(diǎn)。整合酶(integrase,IN),逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)及蛋白酶(protease, PR)是HIV病毒生活史中三個(gè)關(guān)鍵酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA整合到宿主染色體是病毒復(fù)制周期中的重要步驟。HIV基因組通過整合而得以在宿主細(xì)胞中存檔。而且含耐藥性突變HIV基因組的存檔可致使永久性的預(yù)先抵消抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物或所有類別藥物的作用,因此無法持久的抑制病毒和使病人回復(fù)穩(wěn)定的健康狀態(tài)。另外,在人體中不存在己知的整合酶同源蛋白,所以整合酶抑制劑很可能不會(huì)干擾正常的細(xì)胞功能,從而使得該藥物具有毒性低和特異性高的特點(diǎn)。 HIV-1整合酶由病毒pol基因3’末端編碼,含288個(gè)氨基酸殘基,在體內(nèi)以多聚體形式存在及作用。整合酶分子量為32kDa,折疊成3個(gè)結(jié)構(gòu)域,即N末端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain, NTD),核心催化域(core catalytic domain)和C末端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain, CTD)。N末端結(jié)構(gòu)域由1-49位氨基酸殘基組成,形成一個(gè)His2Cys2(HHCC)基序,結(jié)合鋅離子形成鋅指結(jié)構(gòu),促進(jìn)整合酶多聚化并增強(qiáng)其催化活力。核心區(qū)域由第50-212位氨基酸殘基組成,是整合酶催化部位。其中3個(gè)高度保守的酸性氨基酸殘基結(jié)合兩個(gè)二價(jià)金屬陽(yáng)離子(Asp64, Asp116, Glu152, DDE)組成酶的活性中心。C末端結(jié)構(gòu)域由213-288位氨基酸殘基組成,是與DNA結(jié)合的部位。其總體結(jié)構(gòu)與SH3(SRC homomlogy3domain)區(qū)域相似。C末端結(jié)構(gòu)域是整合酶中保守度最小的區(qū)域。整合過程由位于前整合復(fù)合物(preintegration complex, PIC)中的整合酶催化兩個(gè)獨(dú)立反應(yīng)而完成。第一個(gè)反應(yīng)為3’加工(3'-processing)。整合酶與HIV DNA長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)組裝成一個(gè)穩(wěn)定的DNA/酶復(fù)合物。在整合酶的催化下,病毒LTR3’末端的GT雙核苷酸被切除,暴露出3’CA末端。第二步反應(yīng)為鏈轉(zhuǎn)移(Strand transfer)。該反應(yīng)發(fā)生在前整合復(fù)合物穿過核孔進(jìn)入細(xì)胞核后,切割宿主DNA使之產(chǎn)生一個(gè)交錯(cuò)切口,然后病毒DNA的3’末端和5’末端分別連接到宿主DNA的5’末端和3’末端上,從而使病毒DNA整合到宿主基因中。病毒DNA與宿主DNA之間的裂痕由宿主細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行修補(bǔ)。 RAL對(duì)HIV深度感染的病人具有快速持久的病毒抑制作用。而且由于藥物作用機(jī)理不同,RAL能夠同樣有效地抑制其他藥物種類的耐藥毒株。RAL在2009年六月被批準(zhǔn)用于一線抗病毒治療,目前處在無抗病毒治療史患者的臨床Ⅲ期研究中,其中包括每日服用的劑量。第二個(gè)高效的鏈轉(zhuǎn)移抑制劑elvitegravir (EVG, JTK-303/GS-9137)目前處于有抗病毒治療史患者的Ⅲ期臨床研發(fā)中,同時(shí)也作為固定劑量復(fù)合藥物的組分用于無抗病毒治療史患者的Ⅱ期臨床研究。已有的資料表明EVG具有高效的抗病毒效力和低毒性。根據(jù)基因的重要自然變異,HIV-1被分為多個(gè)亞型,流行重組體(circulating recombinant form, CRF)或者獨(dú)特重組體(unique recombinant form, URF)。大多數(shù)現(xiàn)有的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物都是針對(duì)HIV-1B亞型開發(fā)和檢測(cè)的。但全世界范圍內(nèi)大約90%的HIV/AIDS病人感染的為非B亞型病毒。HIV-1非B亞型病毒對(duì)整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑的體內(nèi)和體外藥物易感性評(píng)估很少被報(bào)道。在非B亞型病毒中,流行重組體CRFO2-AG (circulating recombinant form A/G)亞型的感染率在西非地區(qū)極高,近年來在其他國(guó)家如法國(guó)也越來越普遍。已有的酶學(xué)和病毒學(xué)數(shù)據(jù)表明,HIV-1非B亞型基因組中的自然發(fā)生多態(tài)性能夠影響病毒對(duì)某些藥物的易感性。例如,A/G重組亞型對(duì)蛋白酶抑制劑的易感性基線(baseline susceptibility)較低,而且某些A/G病毒株對(duì)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑abacavir的易感性低。對(duì)整合酶氨基酸序列的進(jìn)行的生物信息學(xué)分析表明,CRF02-AG亞型基因組的多態(tài)性,特別其中13個(gè)位點(diǎn)上的重要氨基酸變異(K14R, V31I, L101I, T112V, T124A, T125A, G134N, I135V, K136T, V201I, T206S, L234I及S283G)可能會(huì)影響整合酶的構(gòu)象,以及抑制劑和靶蛋白之間的相互作用,從而影響該亞型病毒整合酶對(duì)抑制劑的藥物易感性。所以有必要比較整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑對(duì)HIV-1B亞型和CRF02-AG亞型的效用,以確定CRF02-AG亞型基因組中的自然發(fā)生多態(tài)性是否影響其對(duì)整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑的易感性,從為臨床治療提供重要指導(dǎo)信息。因此第一部分工作在體外評(píng)估了來源于無抗病毒治療史CRF02-AG感亞型感染者的整合酶對(duì)最新整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑的易感性。 我們利用從尚未接受整合酶抑制劑治療的HIV-1CRF02-AG亞型感染者的血液樣本中分離出的病毒DNA,進(jìn)行擴(kuò)增,克隆以及測(cè)序,分離得到分別含有2個(gè)到7個(gè)上述重要氨基酸變異的4條整合酶編碼序列。隨后同步進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)建模。我們的體外研究結(jié)果表明,CRF02-AG亞型病毒基因組中的自然發(fā)生多態(tài)性并不顯著影響整合酶在體外對(duì)病毒DNA的結(jié)合能力,亦不影響其3’加工和鏈轉(zhuǎn)移催化能力。同時(shí)進(jìn)行的生物信息學(xué)研究得到的結(jié)論與體外實(shí)驗(yàn)一致。利用游離以及結(jié)合病毒DNA的整合酶模型,生物信息學(xué)研究表明兩種亞型的整合酶之間并不存在明顯的結(jié)構(gòu)差異。先前學(xué)者對(duì)HIV-1B和C亞型重組整合酶的研究也獲得了類似結(jié)論。 生物信息學(xué)研究表明,大部分的重要變異氨基酸遠(yuǎn)離整合酶活性中心,雖然第134和136位的兩個(gè)氨基酸靠近活性位點(diǎn),但由于暴露于溶劑中,因此并不嚴(yán)重影響CRF02_AG整合酶的構(gòu)象。而從整合酶模型中觀察到的兩種亞型整合酶催化環(huán)所存在的微弱差異也通過體外3’加工動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明：該差異并不足以影響整合酶活性。 此外,我們的結(jié)果表明這些氨基酸變異也不影響整合酶和抑制劑間的相互作用以及抑制劑的活性。在體外實(shí)驗(yàn)中,兩種亞型整合酶分別受到3種所測(cè)試藥物(RAL,EVG及L-731,983)在相近程度上的抑制。該結(jié)果吻合于生物信息學(xué)建模分析,后者揭示這3種整合酶抑制劑分別對(duì)兩種亞型整合酶的結(jié)合及定位模式并無差異。兩種亞型整合酶和抑制劑作用模式相一致的結(jié)論得到下述數(shù)據(jù)的支持：被認(rèn)為參與和RAL相互作用的HIV-1整合酶殘基C65,T66,H67,N117,F121,T122,A128,G149,及K159在各亞型HIV-1病毒中高度保守。該結(jié)果驗(yàn)證了先前報(bào)道的B和C亞型整合酶不具有藥物易感性差異的結(jié)論。其他的體外研究也發(fā)現(xiàn),從無整合酶抑制劑治療史的HIV-2患者體內(nèi)分離出的毒株亦具有類似的表型易感性。 不同于A/G重組亞型病毒對(duì)蛋白酶抑制劑的低易感性基線,以及某些A/G分離株對(duì)abacavir下降了的易感性,CRF02_AG亞型整合酶的易感性甚至略微高于B型整合酶。盡管酶學(xué)和病毒學(xué)數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)：各種非B亞型中存在的自然發(fā)生多態(tài)性可能影響病毒對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的易感性,且整合酶編碼區(qū)含有的變異率與蛋白酶相當(dāng),但是這種較高程度的流行多態(tài)性卻幾乎不影響對(duì)整合酶抑制劑的易感性,亦甚少與高水平的耐藥性相關(guān)。 另外,在整合酶第140,148,151,157和160位密碼子上觀察到的自然變異和特征多態(tài)性提示,CRF02_AG亞型整合酶可能對(duì)獲得G140S,G140C和V151l耐藥突變具有較高的基因屏障(genetic barrier)。因此,整合酶抑制劑為HIV-1CRF02-AG亞型患者提供了優(yōu)秀的治療選擇。 值得一提的是,我們所分離得到的一條整合酶編碼基因含有一個(gè)重要的整合酶抑制劑耐藥突變Q148K。因?yàn)樵撔蛄衼碓从谖唇?jīng)整合酶抑制劑治療的病人,所以該突變的獲得途徑尚不明了。先前的報(bào)道中也曾發(fā)現(xiàn)類似的情況：從未經(jīng)整合酶抑制劑治療病人中分離出含有整合酶耐藥突變Q148H(G亞型)和Q148K(CRF02_AG亞型)的病毒�！IV-2在西非地區(qū)高度流行,且近二十年逐步向歐洲擴(kuò)散。雖然目前上市的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物多達(dá)7大類23種,但是可用于治療HIV-2感染的藥物種類卻相對(duì)較少。例如,非核苷酸類抑制劑和融合抑制劑不能有效地抑制HIV-2感染；HIV-2對(duì)某些蛋白酶抑制劑的敏感性不高,且由于其產(chǎn)生耐藥突變的基因屏障相對(duì)較低,因此可能更快的產(chǎn)生耐受蛋白酶抑制劑的HIV-2突變株。因此,開發(fā)基于抗HIV-2高效藥物種類的新型治療方法尤為重要。整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑是治療HIV-2患者的一類高效藥物。RAL能有效抑制HIV-2,且表型易感性接近于HIV-1(盡管這兩種整合酶的氨基酸序列差異高達(dá)40%左右)。因此該類藥物為HIV-2感染者提供了更多的藥物選擇。 然而,和其他種類的藥物一樣,RAL的耐藥性通過pol基因中整合酶編碼區(qū)的選擇性突變而分別在體內(nèi)和體外快速出現(xiàn),大幅度降低了病毒對(duì)抑制劑的易感性。在HIV-1中,3條分別涉及N155,Q148和Y143的主要途徑己被確認(rèn)可導(dǎo)致RAL的體內(nèi)耐藥性。使用RAL治療HIV-1時(shí)所產(chǎn)生的病毒學(xué)失敗主要與單獨(dú)出現(xiàn)的(或者與其他次要耐藥性突變共同出現(xiàn)的)N155H或Q148H/K/R這兩條獨(dú)立的耐藥性途徑的發(fā)生有關(guān)。次要突變,如G140S,雖然本身不影響藥物易感性或者影響極小,卻能提高表型耐藥性或者病毒的適應(yīng)性。含Y143突變的第三條耐藥性途徑相對(duì)發(fā)現(xiàn)的較少,且其出現(xiàn)晚于N155和Q148途徑。盡管已發(fā)現(xiàn)60多個(gè)突變與整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑耐藥性相關(guān),但僅Q148,N155或Y143這些重要單突變就足以在體外大幅度降低整合酶對(duì)抑制劑的易感性。最近,對(duì)來源于病毒學(xué)失敗患者的病毒群體所進(jìn)行的表型研究揭示,HIV-2對(duì)RAL的耐藥性很可能也與Q148,N155或Y143這三種主要耐藥突變相關(guān)。通過對(duì)含有定點(diǎn)突變的重組整合酶進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),HIV-1整合酶對(duì)RAL的耐藥性途徑已經(jīng)獲得驗(yàn)證,但是尚未有類似的研究對(duì)HIV-2整合酶耐藥性途徑進(jìn)行驗(yàn)證。HIV-1和HIV-2整合酶在核酸水平上僅有40%相同,在氨基酸水平上的相似性為65%,從而提示可能存在酶對(duì)抑制劑的應(yīng)答,尤其是耐藥性產(chǎn)生機(jī)制方面的差異。所以第二部分工作圍繞HIV-2臨床分離病毒其重組整合酶的體外催化活性和RAL耐藥性而展開。 對(duì)來源于未經(jīng)整合酶抑制劑治療患者的整合酶序列進(jìn)行克隆及分析后發(fā)現(xiàn)：三個(gè)HIV-2B型整合酶在C末端存在重要的氨基酸變異,且蛋白長(zhǎng)度不一。雖然導(dǎo)致B型整合酶蛋白長(zhǎng)度不同的原因尚且不明,但觀察發(fā)現(xiàn)是歸因于核苷酸序列長(zhǎng)度的差異,而不同于先前病毒群體測(cè)序研究中的推測(cè)(該推測(cè)認(rèn)為整合酶蛋白長(zhǎng)度差異由讀碼框中的終止密碼子導(dǎo)致)。這三個(gè)整合酶的催化能力類似且接近HIV-1整合酶的體外催化活性,表明C末端的差異并不影響酶的活性。在體外,HIV-2整合酶催化的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)受RAL抑制的程度亦與HIV-1相當(dāng),該結(jié)果與先前報(bào)道的HIV-1和HIV-2對(duì)該類抑制劑具有類似的表型易感性一致。另外,該結(jié)果也提示RAL與這兩種整合酶的相互作用模式類似。HIV-1整合酶中,推測(cè)與RAL相互作用的殘基C65,T66,H67,N117,F121,T122,D128,G149及K159在HIV-2中完全保守,該觀點(diǎn)為上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了根據(jù)。 根據(jù)文獻(xiàn)中HIV-2病毒群體測(cè)序所提示的三個(gè)主要耐藥突變Q148, N155及Y143,以及本研究中序列克隆分析所鑒定的E92Q(與N155H途徑和Y143C途徑相關(guān)),T97A(與Y143C途徑相關(guān)),我們對(duì)臨床分離病毒的整合酶編碼序列進(jìn)行了克隆分析,發(fā)現(xiàn)了耐藥模式E92A/T97A/N155H,G140S/Q148R和E92Q/143C,從而確定這三種主要耐藥途徑在HIV-2中的存在。在體外實(shí)驗(yàn)中,這三個(gè)重組整合酶被證實(shí)高度耐受RAL,因而確定耐藥性由整合酶編碼序列中的突變引起。隨后通過定點(diǎn)突變野生型整合酶序列,我們發(fā)現(xiàn)N155H單突變和G140S/Q148H雙突變足以在體外引起HIV-2對(duì)RAL的高度耐藥性。在G140S/Q148H模式中,Q148H在引起高水平RAL耐藥性的同時(shí)導(dǎo)致整合酶催化能力的嚴(yán)重缺陷,而次要突變G140S的產(chǎn)生則能夠修復(fù)催化活性,雖然G140S自身并不導(dǎo)致耐藥性。這一結(jié)論與我們先前對(duì)于HIV-1的體外研究完全一致。在HIV-1和HIV-2整合酶中均存在的G140S/Q148H雙突變模式基于整合酶自身的蛋白結(jié)構(gòu),提示逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶中的這兩個(gè)保守殘基間存在著密切的相互作用。 單個(gè)N155H突變導(dǎo)致的耐藥水平與含E92A/T97A/N155H突變的臨床分離株非常接近,這提示E92A和T97A次要突變?cè)贜155H途徑中對(duì)耐藥水平并無重要貢獻(xiàn),該推測(cè)與在整合酶中引入E92A和T97A單突變并不導(dǎo)致耐藥性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。和表型研究文獻(xiàn)一樣,這些結(jié)果均表明：在該途徑中N155H是主要的(即便不是唯一的)耐藥突變。另外該結(jié)果也為先前病毒群體研究中N155H途徑主要出現(xiàn)于HIV-2B亞型的推測(cè)提供了支持。 Y143C/R被認(rèn)為是導(dǎo)致HIV-1對(duì)RAL耐藥性的重要突變之一。我們之前的工作也同樣表明RAL并不能抑制含該單突變的重組HIV-1整合酶的體外催化能力。出乎意料的是,Y143C單突變卻不足以引起HIV-2整合酶的耐藥性,從而排除了其為導(dǎo)致HIV-2整合酶耐藥性之充分條件的可能。由于在臨床分離病毒的整合酶序列中還發(fā)現(xiàn)了E92Q突變,因此我們?cè)谕瑫r(shí)存在Y143C突變的情況下,對(duì)E92Q突變產(chǎn)生的影響作了進(jìn)一步研究。在HIV-1對(duì)RAL的耐藥機(jī)制中,E92Q被認(rèn)為是N155H和Y143C途徑中的次要突變。E92Q在體外實(shí)驗(yàn)中能引起HIV-1整合酶的耐藥性,盡管耐藥水平低于N155H或Q148R。然而在HIV-2整合酶中E92Q單突變亦不足以引起體外耐藥性。但是,通過在野生型整合酶中定點(diǎn)突變獲得的Y143C/E92Q雙突變株在體外實(shí)驗(yàn)中具有耐藥性,這表明盡管Y143C或E92Q單突變均不足以引起對(duì)RAL的耐藥性,但是他們的同時(shí)存在構(gòu)成了HIV-2耐藥途徑之一。所以異于HIV-1,此途徑在HIV-2中需要至少兩個(gè)突變才足以產(chǎn)生耐藥性。從這點(diǎn)看來,先前對(duì)耐藥病毒進(jìn)行克隆分析的文獻(xiàn)中所提到的與Y143C相關(guān)的另外兩個(gè)突變Q91R和T97A也值得進(jìn)一步研究。二者能夠影響到鄰近E92的殘基。最近的結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明RAL能與Y143的側(cè)鏈建立聯(lián)系,我們推測(cè)在HIV-2中,此聯(lián)系的缺失并不足以大幅度減弱RAL對(duì)整合酶的結(jié)合；E92等突變參與的對(duì)RAL結(jié)合位點(diǎn)的再次修飾很可能是產(chǎn)生耐藥性所必需的。 Y143C途徑的產(chǎn)生被推測(cè)為是源于N155H途徑的一個(gè)較晚發(fā)生的轉(zhuǎn)變。我們的數(shù)據(jù)表明高,且由于其產(chǎn)生耐藥突變的基因屏障相對(duì)較低,因此可能更快的產(chǎn)生耐受蛋白酶抑制劑的HIV-2突變株。因此,開發(fā)基于抗HIV-2高效藥物種類的新型治療方法尤為重要。整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑是治療HIV-2患者的一類高效藥物。RAL能有效抑制HIV-2,且表型易感性接近于HIV-1(盡管這兩種整合酶的氨基酸序列差異高達(dá)40%左右)。因此該類藥物為HIV-2感染者提供了更多的藥物選擇。 然而,和其他種類的藥物一樣,RAL的耐藥性通過pol基因中整合酶編碼區(qū)的選擇性突變而分別在體內(nèi)和體外快速出現(xiàn),大幅度降低了病毒對(duì)抑制劑的易感性。在HIV-1中,3條分別涉及N155,Q148和Y143的主要途徑已被確認(rèn)可導(dǎo)致RAL的體內(nèi)耐藥性。使用RAL治療HIV-1時(shí)所產(chǎn)生的病毒學(xué)失敗主要與單獨(dú)出現(xiàn)的(或者與其他次要耐藥性突變共同出現(xiàn)的)N155H或Q148H/K/R這兩條獨(dú)立的耐藥性途徑的發(fā)生有關(guān)。次要突變,如G140S,雖然本身不影響藥物易感性或者影響極小,卻能提高表型耐藥性或者病毒的適應(yīng)性。含Y143突變的第三條耐藥性途徑相對(duì)發(fā)現(xiàn)的較少,且其出現(xiàn)晚于N155和Q148途徑。盡管已發(fā)現(xiàn)60多個(gè)突變與整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑耐藥性相關(guān),但僅Q148,N155或Y143這些重要單突變就足以在體外大幅度降低整合酶對(duì)抑制劑的易感性。最近,對(duì)來源于病毒學(xué)失敗患者的病毒群體所進(jìn)行的表型研究揭示,HIV-2對(duì)RAL的耐藥性很可能也與Q148,N155或Y143這三種主要耐藥突變相關(guān)。通過對(duì)含有定點(diǎn)突變的重組整合酶進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),HIV-1整合酶對(duì)RAL的耐藥性途徑已經(jīng)狀得驗(yàn)證,但是尚未有類似的研究對(duì)HIV-2整合酶耐藥性途徑進(jìn)行驗(yàn)證。HIV-1和HIV-2整合酶在核酸水平上僅有40%相同,在氨基酸水平上的相似性為65%,從而提示可能存在酶對(duì)抑制劑的應(yīng)答,尤其是耐藥性產(chǎn)生機(jī)制方面的差異。所以第二部分工作圍繞HIV-21臨床分離病毒其重組整合酶的體外催化活性和RAL耐藥性而展開。 對(duì)來源于未經(jīng)整合酶抑制劑治療患者的整合酶序列進(jìn)行克隆及分析后發(fā)現(xiàn)：三個(gè)HIV-2B型整合酶在C末端存在重要的氨基酸變異,且蛋白長(zhǎng)度不一。雖然導(dǎo)致B型整合酶蛋白長(zhǎng)度不同的原因尚且不明,但觀察發(fā)現(xiàn)是歸因于核苷酸序列長(zhǎng)度的差異,而不同于先前病毒群體測(cè)序研究中的推測(cè)(該推測(cè)認(rèn)為整合酶蛋白長(zhǎng)度差異由讀碼框中的終止密碼子導(dǎo)致)。這三個(gè)整合酶的催化能力類似且接近HIV-1整合酶的體外催化活性,表明C末端的差異并不影響酶的活性。在體外,HIV-2整合酶催化的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)受RAL抑制的程度亦與HIV-1相當(dāng),該結(jié)果與先前報(bào)道的HIV-1和HIV-2對(duì)該類抑制劑具有類似的表型易感性一致。另外,該結(jié)果也提示RAL與這兩種整合酶的相互作用模式類似。HIV-1整合酶中,推測(cè)與RAL相互作用的殘基C65,T66,H67,N117,F121,T122,D128,G149及K159在HIV-2中完全保守,該觀點(diǎn)為上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了根據(jù)。 根據(jù)文獻(xiàn)中HIV-2病毒群體測(cè)序所提示的三個(gè)主要耐藥突變Q148, N155及Y143,以及本研domain antibody, sdAb),亦稱為VHH抗體(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH)。單域抗體的晶體和水溶性結(jié)構(gòu)由2個(gè)β片層組成支架,類似普通抗體的VH免疫球蛋白折疊。 單域抗體分子量為13kDa。較普通抗體而言,單結(jié)構(gòu)域的特性使之具有一些獨(dú)特的性質(zhì),比如易表達(dá),在Ecoli,真菌和酵母中均能高水平分泌。單域抗體在缺失VL區(qū)的情況下仍具備了特異性結(jié)合抗原的能力以及高親和力。單域抗體的抗原結(jié)合環(huán)比普通抗體VH大,CDR3區(qū)也更長(zhǎng)。人和小鼠VH的CDR3平均長(zhǎng)度分別為12和9個(gè)氨基酸,而單域抗體則為16-18個(gè)氨基酸。這使得它能夠深入結(jié)合蛋白上的裂隙和空腔。另外,單域抗體非常穩(wěn)定且水溶性高,在不形成二硫鍵的情況下仍具有功能。而VH結(jié)構(gòu)域單獨(dú)表達(dá)時(shí)通常形成包涵體,或暴露的疏水域相互黏附。普通抗體的FR2中,4個(gè)疏水性氨基酸殘基(V37,G44,L45和W47)與VL相互作用,而在單域抗體中突變?yōu)橛H水性殘基(F37,E44,R45和G47),從而提高了水溶性。一些單域抗體能耐高溫,且其構(gòu)像具有高度的穩(wěn)定性以及可逆的去折疊能力。單域抗體還顯示出在蛋白酶和極度pH環(huán)境中的高穩(wěn)定性。另外,通過比較人類VH3基因序列與駱駝的VHH胚系基因序列,發(fā)現(xiàn)二者具有高度的同源性；小鼠B或T細(xì)胞亦缺乏對(duì)VHH抗體的免疫應(yīng)答。 由于上述的優(yōu)點(diǎn),靶向HIV病毒不同組分的單域抗體可以開發(fā)為抑制病毒復(fù)制的新藥物。同時(shí),單域抗體也可以作為有效工具以研究靶蛋白在病毒生命周期不同階段所執(zhí)行的分子功能。一些抗HIV病毒蛋白的單域抗體已經(jīng)成功開發(fā),比如靶向HIV-1Rev或Vif的單域抗體在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有抗病毒活性。最近報(bào)道的特異性單域抗體能以高親和力結(jié)合HIV-1Nef,并且在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均抑制Nef的關(guān)鍵生物功能。因此,考慮到整合酶在病毒生活史中的關(guān)鍵作用,第三部分的主要研究目的是利用單域抗體,即駱駝科重鏈抗體高變區(qū),開發(fā)靶向整合酶的特異性單域抗體。 在本研究中通過噬菌體展示技術(shù),特異靶向整合酶的單域抗體被篩選獲得。通過免疫羊駝,特異性擴(kuò)增VHH編碼區(qū)以及克隆于噬菌粒,展示所有VHH表型的噬菌體展示庫(kù)得以建立。特異性抗整合酶單域抗體經(jīng)過幾輪篩選而被鑒定。在體外實(shí)驗(yàn)中,重組抗整合酶單域抗體具有特異性的抗原識(shí)別能力。另外,除識(shí)別HIV-1整合酶,這些單域抗體同樣能夠識(shí)別其他逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶,如HIV-2整合酶,人類泡沫病毒HFV整合酶。這種廣譜的識(shí)別能力推測(cè)是得益于逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶之間,特別是其活性位點(diǎn)間的高度保守性(而這種保守性亦使得HFV整合酶被用作研究HIV整合酶結(jié)構(gòu)的理想原型)。 值得注意的是,這些單域抗體對(duì)HIV-1整合酶突變株G140S/Q148R同樣具有很好的抗原識(shí)別能力。G140S/Q148R是導(dǎo)致整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑耐藥性的主要突變之一,可引起raltegravir和elvitegravir等藥物易感性的急劇減低。該結(jié)果提示,由于單域抗體的抑制機(jī)制與現(xiàn)有鏈轉(zhuǎn)移抑制劑不同,該抗體是一種值得開發(fā)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑。 另外,我們對(duì)單域抗體是否干擾整合酶/表皮生長(zhǎng)因子p75復(fù)合物的形成進(jìn)行了研究。表皮生長(zhǎng)因子p75(LEDGF/p75)是至今為止研究最為深入的前整合復(fù)合物所含細(xì)胞輔助因子。表皮生長(zhǎng)因子p75在前整合復(fù)合物中與整合酶相互作用,協(xié)助復(fù)合物入核,并在染色體牽引,基因組內(nèi)特異位點(diǎn)的整合中起重要作用。但是,體外實(shí)驗(yàn)表明重組單域抗體并不能影響整合酶與表皮生長(zhǎng)因子p75形成復(fù)合體。推測(cè)是由于鑒定得到的單域抗體在整合酶上的結(jié)合位點(diǎn)并不位于(或鄰近)整合酶/表皮生長(zhǎng)因子p75的相互作用位點(diǎn)。 體外酶活性實(shí)驗(yàn)表明,單域抗體不能高效的抑制整合酶催化能力(半數(shù)抑制濃度IC50約為30μM)。對(duì)表達(dá)抗體的細(xì)胞所進(jìn)行的病毒感染實(shí)驗(yàn)表明,胞內(nèi)表達(dá)的抗整合酶單域抗體也不足以抑制HIV的復(fù)制。因?yàn)閷?duì)HIV復(fù)制的有效抑制取決于對(duì)靶蛋白相關(guān)功能區(qū)的中和,所以這些單域抗體的在整合酶上的結(jié)合位點(diǎn)可能并不處于酶的活性位點(diǎn)；或者這些抗體的親和力并不足以中和抑制整合酶活性以及病毒復(fù)制(即使抗體的效用并不與其親和力直接相關(guān))。 另外,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也未能觀察到整合酶和單域抗體的共定位。整合酶趨向于在核內(nèi)表達(dá),而單域抗體則大多表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。該現(xiàn)象與先前抗整合酶scFv的研究結(jié)果類似：抗整合酶scFv表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,被排除于核內(nèi),而融合表達(dá)Tat核定位信號(hào)區(qū)的抗整合酶scFv則定位于細(xì)胞核中,尤其是核內(nèi)膜周圍。 值得注意的是,融合表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的抗整合酶單域抗體的胞內(nèi)表達(dá)水平極高。這種高水平的表達(dá)歸功于該抗體只含有單個(gè)結(jié)構(gòu)域,無需與其他鏈或者區(qū)域配對(duì),亦無需連接肽段,所以能夠在還原性環(huán)境(如真核細(xì)胞的胞質(zhì)和核內(nèi))有效地折疊為具有活性的形式。 此外,我們的實(shí)驗(yàn)還表明,偶聯(lián)抗原于環(huán)氧樹脂顆粒上所進(jìn)行的噬菌體展示庫(kù)篩選是一個(gè)獲得高多樣性結(jié)合物的有效方法。 雖然本實(shí)驗(yàn)中鑒定得到的抗整合酶單域抗體不足以有效抑制HIV感染,但因此該抗體能夠在體外特異性識(shí)別整合酶的同時(shí),保持酶的催化能力；另外作為一個(gè)小蛋白片段(約13kDa),單域抗體很可能不影響所結(jié)合整合酶的空間構(gòu)象,因此該單域抗體可開發(fā)為整合酶俘獲試劑而運(yùn)用于診斷平臺(tái)或納米生物感應(yīng)器。等離子表面共振成像(SPRi)技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)提供分子間結(jié)合,生物大分子相互作用及動(dòng)力學(xué)上的詳細(xì)數(shù)據(jù)。我們利用SPRi的初步研究結(jié)果表明,體外固定化的單域抗體能夠特異性的結(jié)合重組整合酶,且具有較好的親和力。該方法可望進(jìn)一步優(yōu)化及開發(fā)為篩選整合酶藥物的高通量平臺(tái)以及用于藥物／整合酶作用機(jī)制的研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R512.91;R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1527474