本文關(guān)鍵詞： 細(xì)粒棘球蚴 囊型包蟲病 抗原B 樹突狀細(xì)胞 免疫耐受　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的: 本研究旨在觀察囊型包蟲病患者(CE)外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)表面TLRs及與血清細(xì)胞因子之間的相互關(guān)系,明確哪種模式識(shí)別受體(PRRs)參與了CE的慢性感染過(guò)程中IL-10的產(chǎn)生,討論包蟲病病人免疫耐受可能的原因;并進(jìn)一步分析在包蟲病患者PBMC衍生的樹突狀細(xì)胞(MoDC)形態(tài)、表型特點(diǎn)及成熟狀態(tài)等,觀察天然免疫細(xì)胞在包蟲病病人中對(duì)免疫耐受的影響,從臨床角度驗(yàn)證并分析包蟲致宿主免疫耐受方面的機(jī)制。進(jìn)而再通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)應(yīng)用包蟲主要抗原刺激DCs后檢測(cè)吲哚胺2, 3-雙加氧酶(IDO)的表達(dá),研究作為免疫耐受相關(guān)分子的IDO是否參與到了CE慢性感染中,并促進(jìn)了宿主的免疫耐受,進(jìn)一步確定TLRs、DCs與IDO之間有何聯(lián)系,并且評(píng)價(jià)抗原B(AgB)潛在的免疫調(diào)節(jié)作用。 方法: 課題第一部分:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)法檢測(cè)34例囊型包蟲病患者(cystic echinococcosis,CE組)與22例健康對(duì)照者(healthy control,HC組)外周血單核細(xì)胞(PBMC)中TLR2、4mRNA的表達(dá),GAPDH作為內(nèi)參基因;應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)兩組血清中IFN-γ、IL-12p70、IL-10、IL-4、IL-17A的濃度,并且對(duì)TLR2、4的表達(dá)水平間及它們與血清細(xì)胞因子水平間的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。 課題第二部分:先分別采用磁珠分選法、貼壁法對(duì)正常人PBMC進(jìn)行培養(yǎng),應(yīng)用重組人集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)誘導(dǎo)獲得MoDCs。倒置顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)評(píng)定獲得的MoDCs質(zhì)量;再根據(jù)所建立的人MoDCs的體外培養(yǎng)方法將CE患者、健康志愿者的PBMC誘導(dǎo)成為MoDCs后采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MoDC表面標(biāo)志物如CD1a、CD80、CD86、HLA-DR的陽(yáng)性表達(dá)情況,并結(jié)合MLR檢測(cè)兩組MoDCs刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力,說(shuō)明DCs是否存在表型缺陷與成熟障礙。 課題第三部分:在體外實(shí)驗(yàn)的條件下,獲得C57BL/6小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs),并進(jìn)行鑒定。用15μg/ml rAgB刺激BMDCs 24h,采用細(xì)胞免疫組織化學(xué)法初步檢測(cè)有無(wú)IDO表達(dá);其次再分別應(yīng)用15μg/ml rAgB、5mg/ml小鼠囊型包蟲囊液(MHF)、1,000U/ml IFN-γ(陽(yáng)性對(duì)照)刺激C57BL/6小鼠BMDCs,在6h、18h、24h、48h、60h采用QRT-PCR動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)IDO、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)情況;并在不同時(shí)間點(diǎn)收集各組DCs后應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)IDO的蛋白表達(dá)情況。利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)動(dòng)態(tài)檢測(cè)細(xì)胞上清中色氨酸的濃度以反映IDO的活性。 結(jié)果: 課題第一部分:慢性CE組的TLR2、TLR4的mRNA相對(duì)表達(dá)量均比HC組的表達(dá)增高(P0.05);血清中細(xì)胞因子IL-10、IL-4、IL-12p70的濃度在CE組中均比在HC組中的濃度高,兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但I(xiàn)FN-γ、IL-17A的濃度在兩組中的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在CE組中,TLR2、TLR4分別與血清IL-10有正相關(guān);TLR2與血清IL-12p70有相關(guān)性,但相關(guān)性弱。而TLR4則與血清IL-12p70無(wú)相關(guān)性。TLR與其它細(xì)胞因子無(wú)相關(guān)性,P值均0.05。 課題第二部分:經(jīng)貼壁培養(yǎng)2 h后的人外周血PBMCs再行誘導(dǎo)可獲得形態(tài)與功能較優(yōu)的DCs,且此法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),是一種適于基礎(chǔ)、臨床研究的DCs體外培養(yǎng)方法。根據(jù)所建立的方法誘導(dǎo)出CE組、HC組的MODCs,并在倒置顯微鏡下觀察到CE組MoDCs表面的樹突狀突起較少。與HC組比較,CE組的MoDCs細(xì)胞表面的CD1a、CD80、CD86、HLA-DR表達(dá)降低(P0.05)。在MLR中,CE患者的MoDCs刺激T細(xì)胞增殖的能力低于HC組(P0.05); 課題第三部分:獲得了純度高且形態(tài)典型的DCs。經(jīng)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)、MLR結(jié)果表明誘導(dǎo)形成的DCs表達(dá)相關(guān)表面標(biāo)志物,且具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力。QRT-PCR的結(jié)果顯示,在rAgB-DCs組中,IDO在24h時(shí)明顯上調(diào),而IL-10、TLR2、TLR4均在48h時(shí)顯著上調(diào)。在MHF-DCs組中,干預(yù)24h時(shí)IDO、IL-10、TLR2、TLR4均可被上調(diào),并達(dá)到最高值。蛋白檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),在rAgB組中,IDO在24h時(shí)出現(xiàn)明顯條帶,而從24h到60h,IDO的表達(dá)逐漸減弱。在MHF處理組中,DCs表達(dá)的IDO在48h時(shí)具有明顯的條帶。RP-HPLC結(jié)果顯示,在各干預(yù)組處理DCs24h時(shí),以rAgB組中Try的濃度為最低,IFN-γ為其次,MHF組中的Try濃度比rAgB、IFN-γ兩組的都高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論: (1)TLR2、TLR4參與了囊型包蟲病的慢性發(fā)生發(fā)展過(guò)程,TLR2、TLR4可作為囊性包蟲抗原的受體,與不同抗原成分相互作用,調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。TLR的表達(dá)參與了細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),使包蟲逃避了宿主的免疫監(jiān)視。在CE的慢性感染中,血清IL-10水平的分泌增高,可能在保護(hù)寄生蟲的生長(zhǎng)、在宿主體內(nèi)存活以逃避宿主的免疫殺傷方面發(fā)揮作用,促使機(jī)體向Th2型免疫應(yīng)答方向發(fā)展,形成了囊型包蟲的慢性感染。 (2)通過(guò)成功誘導(dǎo)人MoDCs,建立了研究DCs與包蟲之間相互關(guān)系的平臺(tái);CE組所誘導(dǎo)的MoDCs形態(tài)不典型,表面標(biāo)志物的表達(dá)降低,說(shuō)明CE的MoDCs存在受損,成熟發(fā)生障礙及對(duì)T細(xì)胞的刺激能力減弱可能是包蟲致免疫耐受的發(fā)病機(jī)制之一。 (3)利用體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rAgB、包蟲囊液都可以上調(diào)DCs表面IDO的表達(dá)。在一定時(shí)間內(nèi)rAgB上調(diào)IDO表達(dá)的能力強(qiáng)于MHF上調(diào)IDO表達(dá)的能力;IDO與IL-10的mRNA水平分別在不同的時(shí)間點(diǎn)可被上調(diào),并且IL-10mRNA的上調(diào)延遲于IDOmRNA的上調(diào),說(shuō)明IDO可通過(guò)TLR2、TLR4的上調(diào)并在細(xì)胞因子IL-10的作用下被激活。在CE的慢性感染過(guò)程中,IDO作為調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)的分子開關(guān)可能在Th2型反應(yīng)中發(fā)揮著主導(dǎo)作用,形成了“IDO-依賴的免疫逃避”假說(shuō),顯示了IDO可能抑制炎癥反應(yīng),在棘球蚴致機(jī)體免疫耐受中起到了一定的作用,為進(jìn)一步闡明囊性包蟲病的天然免疫發(fā)病機(jī)制及探索新的免疫治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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