本文關鍵詞： 細粒棘球蚴 囊型包蟲病 抗原B 樹突狀細胞 免疫耐受　出處：《新疆醫(yī)科大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的: 本研究旨在觀察囊型包蟲病患者(CE)外周血中單個核細胞(PBMC)表面TLRs及與血清細胞因子之間的相互關系,明確哪種模式識別受體(PRRs)參與了CE的慢性感染過程中IL-10的產生,討論包蟲病病人免疫耐受可能的原因;并進一步分析在包蟲病患者PBMC衍生的樹突狀細胞(MoDC)形態(tài)、表型特點及成熟狀態(tài)等,觀察天然免疫細胞在包蟲病病人中對免疫耐受的影響,從臨床角度驗證并分析包蟲致宿主免疫耐受方面的機制。進而再通過體外實驗應用包蟲主要抗原刺激DCs后檢測吲哚胺2, 3-雙加氧酶(IDO)的表達,研究作為免疫耐受相關分子的IDO是否參與到了CE慢性感染中,并促進了宿主的免疫耐受,進一步確定TLRs、DCs與IDO之間有何聯(lián)系,并且評價抗原B(AgB)潛在的免疫調節(jié)作用。 方法: 課題第一部分:采用實時熒光定量PCR(QRT-PCR)法檢測34例囊型包蟲病患者(cystic echinococcosis,CE組)與22例健康對照者(healthy control,HC組)外周血單核細胞(PBMC)中TLR2、4mRNA的表達,GAPDH作為內參基因;應用ELISA方法檢測兩組血清中IFN-γ、IL-12p70、IL-10、IL-4、IL-17A的濃度,并且對TLR2、4的表達水平間及它們與血清細胞因子水平間的關系進行相關分析。 課題第二部分:先分別采用磁珠分選法、貼壁法對正常人PBMC進行培養(yǎng),應用重組人集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細胞介素-4(rhIL-4)誘導獲得MoDCs。倒置顯微鏡、流式細胞術與混合淋巴細胞反應(MLR)評定獲得的MoDCs質量;再根據(jù)所建立的人MoDCs的體外培養(yǎng)方法將CE患者、健康志愿者的PBMC誘導成為MoDCs后采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞術檢測MoDC表面標志物如CD1a、CD80、CD86、HLA-DR的陽性表達情況,并結合MLR檢測兩組MoDCs刺激同種異體T淋巴細胞的增殖能力,說明DCs是否存在表型缺陷與成熟障礙。 課題第三部分:在體外實驗的條件下,獲得C57BL/6小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(BMDCs),并進行鑒定。用15μg/ml rAgB刺激BMDCs 24h,采用細胞免疫組織化學法初步檢測有無IDO表達;其次再分別應用15μg/ml rAgB、5mg/ml小鼠囊型包蟲囊液(MHF)、1,000U/ml IFN-γ(陽性對照)刺激C57BL/6小鼠BMDCs,在6h、18h、24h、48h、60h采用QRT-PCR動態(tài)監(jiān)測IDO、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA相對表達情況;并在不同時間點收集各組DCs后應用Western blotting方法檢測IDO的蛋白表達情況。利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)動態(tài)檢測細胞上清中色氨酸的濃度以反映IDO的活性。 結果: 課題第一部分:慢性CE組的TLR2、TLR4的mRNA相對表達量均比HC組的表達增高(P0.05);血清中細胞因子IL-10、IL-4、IL-12p70的濃度在CE組中均比在HC組中的濃度高,兩組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),但IFN-γ、IL-17A的濃度在兩組中的差異則無統(tǒng)計學意義(P0.05)。在CE組中,TLR2、TLR4分別與血清IL-10有正相關;TLR2與血清IL-12p70有相關性,但相關性弱。而TLR4則與血清IL-12p70無相關性。TLR與其它細胞因子無相關性,P值均0.05。 課題第二部分:經貼壁培養(yǎng)2 h后的人外周血PBMCs再行誘導可獲得形態(tài)與功能較優(yōu)的DCs,且此法穩(wěn)定、簡便、經濟,是一種適于基礎、臨床研究的DCs體外培養(yǎng)方法。根據(jù)所建立的方法誘導出CE組、HC組的MODCs,并在倒置顯微鏡下觀察到CE組MoDCs表面的樹突狀突起較少。與HC組比較,CE組的MoDCs細胞表面的CD1a、CD80、CD86、HLA-DR表達降低(P0.05)。在MLR中,CE患者的MoDCs刺激T細胞增殖的能力低于HC組(P0.05); 課題第三部分:獲得了純度高且形態(tài)典型的DCs。經流式細胞儀的檢測、MLR結果表明誘導形成的DCs表達相關表面標志物,且具有刺激T淋巴細胞增殖能力。QRT-PCR的結果顯示,在rAgB-DCs組中,IDO在24h時明顯上調,而IL-10、TLR2、TLR4均在48h時顯著上調。在MHF-DCs組中,干預24h時IDO、IL-10、TLR2、TLR4均可被上調,并達到最高值。蛋白檢測中發(fā)現(xiàn),在rAgB組中,IDO在24h時出現(xiàn)明顯條帶,而從24h到60h,IDO的表達逐漸減弱。在MHF處理組中,DCs表達的IDO在48h時具有明顯的條帶。RP-HPLC結果顯示,在各干預組處理DCs24h時,以rAgB組中Try的濃度為最低,IFN-γ為其次,MHF組中的Try濃度比rAgB、IFN-γ兩組的都高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論: (1)TLR2、TLR4參與了囊型包蟲病的慢性發(fā)生發(fā)展過程,TLR2、TLR4可作為囊性包蟲抗原的受體,與不同抗原成分相互作用,調節(jié)宿主的免疫應答。TLR的表達參與了細胞因子的調節(jié),使包蟲逃避了宿主的免疫監(jiān)視。在CE的慢性感染中,血清IL-10水平的分泌增高,可能在保護寄生蟲的生長、在宿主體內存活以逃避宿主的免疫殺傷方面發(fā)揮作用,促使機體向Th2型免疫應答方向發(fā)展,形成了囊型包蟲的慢性感染。 (2)通過成功誘導人MoDCs,建立了研究DCs與包蟲之間相互關系的平臺;CE組所誘導的MoDCs形態(tài)不典型,表面標志物的表達降低,說明CE的MoDCs存在受損,成熟發(fā)生障礙及對T細胞的刺激能力減弱可能是包蟲致免疫耐受的發(fā)病機制之一。 (3)利用體外實驗發(fā)現(xiàn)rAgB、包蟲囊液都可以上調DCs表面IDO的表達。在一定時間內rAgB上調IDO表達的能力強于MHF上調IDO表達的能力;IDO與IL-10的mRNA水平分別在不同的時間點可被上調,并且IL-10mRNA的上調延遲于IDOmRNA的上調,說明IDO可通過TLR2、TLR4的上調并在細胞因子IL-10的作用下被激活。在CE的慢性感染過程中,IDO作為調節(jié)宿主反應的分子開關可能在Th2型反應中發(fā)揮著主導作用,形成了“IDO-依賴的免疫逃避”假說,顯示了IDO可能抑制炎癥反應,在棘球蚴致機體免疫耐受中起到了一定的作用,為進一步闡明囊性包蟲病的天然免疫發(fā)病機制及探索新的免疫治療靶點奠定基礎。
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【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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