本文關鍵詞： 產腸毒素大腸桿菌 腸毒素 腹瀉 疫苗 融合蛋白　出處：《大連理工大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：產腸毒素大腸桿菌(ETEC)能夠引起多種幼齡動物以及嬰幼兒的胃腸道感染與嚴重腹瀉,給各國的畜牧養(yǎng)殖業(yè)及人類健康帶來極大的危害。疫苗接種是預防ETEC感染的有效手段,它避免了抗生素濫用所帶來的藥物殘留及細菌產生耐藥性等問題,是多年來重要的研究方向。耐熱性腸毒素(ST)是ETEC的重要毒力因子,它是免疫原性很弱的小分子半抗原,如何將ST與大分子載體偶聯使其具備良好的免疫原性并消除其天然毒性是ETEC疫苗研究中的難點�，F有ETEC疫苗中均不含有ST組分,不能誘導有效的抗毒素免疫,因此免疫保護效果有待提高。 為了獲得更有效的ETEC疫苗,本論文的研究目的是將編碼兩種ST分子(STa、STb)的基因與不耐熱腸毒素B亞基(LTB)的基因進行融合,進而制備3價融合ETEC腸毒素的DNA疫苗與蛋白疫苗,其特征是含有3種ETEC重要腸毒素毒力因子(分別為LTB、STa, STb)的抗原表位,能夠引起抗3種腸毒素的特異性抗體反應,為機體提供全面的抗毒素免疫,從而提高ETEC疫苗的保護率。本論文主要工作如下： (1)多價腸毒素DNA疫苗的研究：應用重疊延伸PCR技術擴增獲得了雞胰島素信號肽的基因ins和雞尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑的信號肽基因upa,將腸毒素基因LTB、STa、STb及信號肽基因進行連接得到多價融合基因,在相鄰的腸毒素基因之間設計了編碼5-7個氨基酸的連接肽序列,將融合基因插入真核表達載體pCI,獲得了3種多價腸毒素真核表達質粒pCI-ins-SLS、pCI-upa-SLS、pCI-SLS。經DNA測序證明,所構建的表達載體目標基因序列正確。利用柱層析法純化DNA疫苗,經脂質體介導轉染體外培養(yǎng)的Hela細胞進行瞬時表達實驗,免疫熒光實驗的結果表明所構建的真核表達質粒能夠表達目的重組蛋白。用3種DNA疫苗免疫產蛋母雞,ELISA測定表明獲得了LTB特異性抗體,但STa及STb特異性抗體的效價較低；用其中不帶信號肽的DNA疫苗pCI-SLS免疫小鼠,獲得了高水平的抗LTB、STa及STb的特異性血清抗體,該抗血清具有中和STb毒性的活性,但沒有STa的中和活性,在小鼠攻毒保護實驗中提供了50%的保護率,與對照組相比有顯著差別(P0.05) (2)多價腸毒素蛋白疫苗的研究：首先利用PCR法擴增獲得了三種腸毒素LTB、STa、STb的編碼基因,應用“限制性內切酶酶切-連接酶連接”等基因工程手段將腸毒素基因LTB、STa、STb進行連接得到三價融合基因LTB-STa-STb,每兩段相鄰的基因之間設計了編碼7個氨基酸的連接肽序列。又以質粒pCI-SLS為模板擴增得到了三價融合基因STa-LTB-STb。將融合基因克隆入原核表達載體pET-30a,獲得了2種三價腸毒素原核表達質粒pET30-LSS和pET30-SLS,轉化入宿主菌E. coli BL21(DE3)中后經誘導劑IPTG誘導,聚丙烯酞胺凝膠電泳及蛋白質免疫印跡檢測實驗表明成功的表達了重組三價腸毒素融合蛋白LSS和SLS,分子量均為21 kDa。使用鎳離子瓊脂糖凝膠色譜柱進行親和層析,獲得了純化的重組三價腸毒素蛋白。用兩種三價腸毒素蛋白疫苗免疫母雞及小鼠,通過ELISA法檢測抗體效價,結果表明在兩種動物都獲得了較高水平的抗LTB、STa及STb免疫反應,多價抗毒素能夠中和STa及STb的毒性,在小鼠攻毒保護實驗中提供了50-70%的保護率,與對照組相比有顯著差別(P0.05)。 綜上所述,本論文構建的2種三價腸毒素重組蛋白LSS和SLS,同時具有ETEC的三種腸毒素(LTB、STa及STb)免疫原性,免疫動物可引發(fā)全面的保護性抗毒素免疫反應,從而能對所有菌毛類型的ETEC致病菌株產生有效的免疫保護,為廣譜性ETEC疫苗的研究打下基礎。在本論文構建的三價腸毒素DNA疫苗中,STa及STb的免疫原性有所提高,但低于相應的蛋白抗原。
[Abstract]:Heat - resistant enterotoxin ( ST ) is an important virulence factor of ETEC . It is an important virulence factor for ETEC . How to couple ST with macromolecule carrier makes it possess good immunogenicity and to eliminate its natural toxicity is a difficult problem in ETEC vaccine research . In order to obtain a more effective ETEC vaccine , the aim of this paper is to fuse the genes encoding two ST molecules ( STa , STb ) with non - heat - labile Enterotoxin B subunit ( LTB ) gene . ( 1 ) Study on the DNA Vaccine of Multi - valent Enterotoxin : The signal peptide gene upa of chicken insulin signal peptide and plasminogen activator of chicken urokinase type were amplified by overlapping extension PCR . ( 2 ) The research of multivalent Enterotoxin protein vaccine : Firstly , the coding genes of three kinds of enterotoxins LTB , STa and STb were amplified by PCR method . The genes LTB , STa and STb were ligated to obtain three - valence fusion gene LTB - STa - STb . coli BL21 ( DE3 ) was transformed into E . coli BL21 ( DE3 ) , induced by IPTG . The results showed that the recombinant three - valent Enterotoxin fusion protein was successfully expressed , and the molecular weight was 21 kDa . Two kinds of three - valent Enterotoxin protein vaccine were used to immunoaffinity chromatography . The results showed that the two kinds of three - valent Enterotoxin protein vaccine were used to test the antibody titer . The results showed that both the two animals had higher levels of anti - LTB , STa and STb immune responses . In conclusion , two kinds of three - valent Enterotoxin recombinant proteins ( LTB , STa and STb ) , which were constructed by this paper , were immunogenic , and the immunized animals could induce a comprehensive protective immune response to ETEC vaccine . The results showed that the immunogenicity of STa and STb increased , but lower than the corresponding protein antigens .

【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【引證文獻】

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1 趙姝靜;大腸桿菌腸毒素卵黃抗體的制備及其抗毒素特性研究[D];東北農業(yè)大學;2013年

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本文編號：1520368