本文關鍵詞： 人胚胎干細胞 表觀修飾 多能性維持 CARM1 Nanog MicroRNAs　出處：《第二軍醫(yī)大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景和目的 人胚胎干細胞（hESC）是從人類早期胚胎內(nèi)細胞團（ICM）分離出來的高度未分化的多能性細胞，具有無限增殖的能力，并經(jīng)誘導可分化為不同類型的組織細胞。因此，人胚胎干細胞可作為理想的實驗材料而用于醫(yī)學、生物學、藥學等方面的研究。目前認為與維持hESC分化潛能相關的轉(zhuǎn)錄因子是Oct4、Nanog和Sox2，對這組轉(zhuǎn)錄因子上游調(diào)控信號通路的研究目前主要集中于IGF、FGF受體以及TGFβ通路的研究，表觀遺傳調(diào)控通路的研究鮮有報道。2007年Nature雜志報道，有研究者通過向早期鼠胚（2~4細胞期）卵裂球顯微注射共刺激因子相關精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（CARM1）后，卵裂球內(nèi)染色體的組蛋白甲基化水平升高，同時使卵裂球核內(nèi)Nanog的水平顯著升高，最終導致卵裂球向ICM分化。 組蛋白修飾在hESC自我更新和分化中起著舉足輕重的作用。組蛋白賴氨酸甲基化已被證明與hESC多能性維持以及體細胞的重編有關，而對組蛋白精氨酸甲基化相應的研究卻是一片空白。CARM1作為一種組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，其催化的位點包括組蛋白H3N端的l7、26位以及C端的128、129、131、134位精氨酸(H3R17，26，，128，129，131，134)，對轉(zhuǎn)錄有直接調(diào)節(jié)作用的位點分別是H3R17和26。最近人們還找到了CARM1的特異性抑制劑，這為CARM1的功能研究提供有利條件。 MicroRNAs（miRNAs）是一段包含18~22bp長度的RNA分子，在體內(nèi)也可以接受各種信號轉(zhuǎn)導通路和轉(zhuǎn)錄因子變化的調(diào)控，通過堿基互補與靶mRNA部分或者完全結(jié)合，誘導靶mRNA的切割或者翻譯抑制，調(diào)控基因的表達。已有研究者篩選出了在ESCs中特異性表達的miRNAs，最近的研究還發(fā)現(xiàn)上百條miRNAs在hESC分化前后出現(xiàn)了顯著的表達差異。 本實驗發(fā)現(xiàn)共刺激因子相關精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（CARM1）不僅能影響早期鼠胚細胞中Nanog的表達水平，還能影響hESC中Nanog的表達。同時運用生物信息學的方法，我們預測了靶向CARM1的12條miRNAs，并最終證明MicroRNA181家族能直接靶向CARM1，調(diào)控其在hESC中的表達。綜上所述，本研究證明了CARM1在維持hESC多能性過程中扮演重要作用，揭示了組蛋白甲基化修飾、microRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控協(xié)調(diào)參與到hESC的多能性調(diào)控網(wǎng)絡中的方式和機制，為hESC多能性調(diào)控找到一條全新的表觀修飾通路。第一部分：CARM1對早期鼠胚細胞和hESC多能性的影響 方法:(1)CARM1mRNA的合成以及重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag－-CARM1的構(gòu)建：通過PCR獲得CARM1全長模板，使用mRNA體外合成試劑盒合成CARM1mRNA。將CARM1全長片段連接入pcDNA3.1-flag－載體中，獲得pcDNA3.1-flag－-CARM1真核表達載體。(2)早期鼠胚中CARM1過表達模型和hESC中CARM1過表達模型、knock-down模型的建立以及分析：通過顯微注射系統(tǒng)將CARM1mRNA注射入二細胞期鼠胚的其中一個細胞。利用脂質(zhì)體將pcDNA3.1-flag－-CARM1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入hESC中。設計CARM1特異性siRNA，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入hESC中，構(gòu)建CARM1的knock-down模型。分別通過免疫熒光法和Realtime-PCR法、Westernblot法等檢測各模型中Nanog等轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，利用Realtime-PCR法檢測CARM1的knock-down模型中三胚層分化Marker的表達情況，利用堿性磷酸酶（AP）染色比較CARM1knock-down組與對照組之間hESC的形態(tài)差異。(3)CARM1對hESC誘導分化后的形態(tài)變化的影響：通過撤除培養(yǎng)基中的bFGF誘導hESC分化，利用堿性磷酸酶（AP）染色比較CARM1過表達組與對照組之間hESC的形態(tài)差異，結(jié)果：(1) CARM1mRNA長度在2000nt以上，與預計長度相同。pcDNA3.1-flag－-CARM1重組質(zhì)粒測序鑒定，與CARM1序列完全匹配。(2) CARM1mRNA注射入早期二細胞期鼠胚其中一個細胞，發(fā)育至四細胞期后的注射組細胞Nanog水平上調(diào)。hESC中過表達CARM1后，Nanog水平和對照組比較顯著升高。Knock-down CARM1后，Nanog水平和對照組比較顯著下調(diào)，三胚層分化Marker的表達水平顯著上調(diào)。CARM1knock-down組與對照組比較克隆形成數(shù)減少，形態(tài)減小，AP染色陽性克隆顯著減少。(3)CARM1過表達組與對照組相比，能在一定時間內(nèi)維持hESC克隆的形態(tài)與數(shù)量。結(jié)論：(1)CARM1mRNA的合成以及重組質(zhì)粒pcDNA3.1-flag－-CARM1的構(gòu)建成功。(2)CARM1能上調(diào)早期鼠胚細胞以及hESC中Nanog的表達水平。(3) CARM1能維持hESC的多能性，抵抗分化。第二部分：CARM1維持hESC多能性機制的研究 方法:在hESC的CARM1過表達模型和knock-down模型中，利用ChIP技術分別分析Nanog、Oct4、Sox2分子啟動子區(qū)CARM1以及H3R17甲基化水平的變化。結(jié)果：CARM1過表達模型中Nanog、Oct4、Sox2分子啟動子區(qū)有CARM1和H3R17甲基化的富集。CARM1knock-down模型中上述轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)CARM1和H3R17甲基化水平均顯著下調(diào)。結(jié)論： CARM1能通過催化Nanog、Oct4、Sox2等轉(zhuǎn)錄因子啟動子區(qū)H3R17的甲基化修飾，激活轉(zhuǎn)錄，上調(diào)Nanog的水平，從而維持hESC的多能性。第三部分：miR-181通過靶向CARM1影響hESC多能性 方法:(1) hESC誘導分化過程中CARM1的表達水平以及組蛋白精氨酸甲基化水平差異的研究：通過撤除培養(yǎng)基中的bFGF誘導hESC分化，利用Realtime-PCR檢測hESC促分化后CARM1轉(zhuǎn)錄水平的變化，利用Westernblot技術檢測hESC促分化后CARM1翻譯水平的變化以及組蛋白H3R17甲基化水平的變化(2) hESC中靶向CARM1的miRNAs的確定：通過Targetscan網(wǎng)站，預測12條直接靶向CARM13端非翻譯區(qū)(3’UTR)的miRNAs，利用Realtime-PCR技術檢測上述12條miRNAs在hESC促分化后的表達情況，篩選出在hESC促分化后高表達的miRNAs作為候選miRNAs。然后在HEK293細胞中利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗確定候選miRNAs是否能靶向CARM1的3’UTR。（3）miR-181對hESC多能性影響的研究：篩選出miR-181家族miR-181a/b/c/d后，選取miR-181c，合成miR-181c的mimics，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入hESC中，檢測CARM1的表達情況，同時檢測Nanog、Oct4、Sox2等轉(zhuǎn)錄因子以及三胚層分化Marker的表達情況，利用AP染色比較miR-181c過表達組與對照組之間hESC的形態(tài)差異。（4）外源性CARM1恢復miR-181造成的多能性喪失的研究：將miR-181cmimics和無3’UTR的CARM1表達載體pcDNA3.1-flag－-CARM1共轉(zhuǎn)染入hESC中，檢測Nanog、Oct4、Sox2等轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，利用AP染色比較共轉(zhuǎn)染組與miR-181c過表達組之間hESC的形態(tài)差異。結(jié)果：(1) hESC促分化后，CARM1轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著下調(diào)，H3R17甲基化水平亦顯著下調(diào)。(2) miR-181家族miR-181a/b/c/d的表達在hESC促分化后均顯著增加，雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗提示miR-181家族的四條miRNAs均能靶向CARM1的3’UTR（3）miR-181c過表達后，hESC中CARM1顯著下調(diào)，Nanog、Oct4、Sox2表達均下調(diào)，三胚層分化Marker的表達顯著上調(diào)。miR-181c過表達組與對照組比較，hESC克隆形成數(shù)減少，形態(tài)減小，AP染色陽性克隆顯著減少。（4）miR-181c和CARM1表達載體的共轉(zhuǎn)染組Nanog、Oct4、Sox2表達較miR-181c過表達組顯著上調(diào)，三胚層分化Marker下調(diào)，AP染色陽性克隆數(shù)增加。結(jié)論：(1) hESC促分化過程中CARM1下調(diào)，組蛋白精氨酸甲基化水平下調(diào)，影響hESC多能性的維持。(2) miR-181能直接靶向CARM1，是CARM1的上游調(diào)控分子。（3）miR-181c能通過下調(diào)CARM1的表達，影響或部分影響hESC多能性的維持，促進hESC分化。（4）CARM1能在一定程度內(nèi)恢復hESC多能性。 小結(jié) 本研究驗證了早期鼠胚細胞中CARM1能上調(diào)Nanog的表達水平，提出并證實了在hESC中CARM1能通過催化Nanog、Oct4、Sox2啟動子區(qū)組蛋白H3R17的甲基化修飾，上調(diào)Nanog的表達，從而維持hESC的多能性。本研究成功篩選并驗證了在hESC中能調(diào)控CARM1的上游信號分子miR-181。盡管MicroRNAs參與干細胞多能性調(diào)控的通路屢見不鮮，但是microRNA與組蛋白甲基化修飾，特別是與組蛋白精氨酸甲基化修飾協(xié)同參與表觀遺傳學調(diào)控的通路未見報道，本研究首次提出并證實了miR-181通過靶向CARM1，影響Nanog表達水平，并最終影響hESC多能性的通路，為hESC多能性的維持找到了新的有效的手段。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1509446