本文關(guān)鍵詞： 猬迭宮絳蟲 裂頭蚴 半胱氨酸蛋白酶基因 原核表達(dá) 生物信息學(xué)　出處：《中國人獸共患病學(xué)報》2017年02期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的克隆、表達(dá)猬裂頭蚴27kDa半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)基因,并分析其生物學(xué)特性。方法提取蛇源猬裂頭蚴總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴增27kDa半胱氨酸蛋白酶(27kDa CP)基因,克隆入pMD-19T載體,測序正確后將27kDa-CP基因亞克隆入表達(dá)載體pET-28a(+),構(gòu)建pET-28a(+)-27kDa-CP重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Transetta(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),表達(dá)目的蛋白27kDa CP。用鎳離子柱親和層析法純化目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE及Western Blotting進行分析,并運用NCBI和ExPASy等有關(guān)的生物信息學(xué)分析工具,對27CP基因及其編碼蛋白進行預(yù)測和分析。結(jié)果 CP基因序列的開放閱讀框長為1 011bp,去除信號肽序列長954bp,登錄到GenBank,獲得登錄號ANA52569。該基因編碼一個含317個氨基酸的蛋白多肽,屬于Peptidase_C39_like超家族,理論分子量約35 669.9Da,等電點5.92。pET-28a(+)-27kDa-CP重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,蛋白在大腸埃希菌中成功表達(dá),經(jīng)純化后的蛋白利用Western blotting檢測,證明與預(yù)期大小相符,且與猬裂頭蚴感染陽性血清有較好的結(jié)合反應(yīng)。結(jié)論成功克隆、表達(dá)了猬裂頭蚴27kDa CP基因,獲知CP基因及其編碼的氨基酸序列和生物信息學(xué)。
[Abstract]:Objective to clone and express the 27kDa cysteine protease (CPN) gene and analyze its biological characteristics. Methods the 27kDa cysteine protease 27kDa CPG gene was amplified by reverse transcription synthesis and cloned into pMD-19T vector. After sequencing correctly, the 27kDa-CP gene was subcloned into the expression vector pET-28a (pET-28a). The recombinant plasmid pET-28a (pET-28a CP) was transformed into E. coli TransettaDa-DE3 and induced by IPTG. The expressed protein was purified by nickel ion column affinity chromatography. The expressed protein was analyzed by SDS-PAGE and Western Blotting, and the bioinformatics analysis tools such as NCBI and ExPASy were used. Results the open reading frame length of CP gene sequence was 1 011bp. the length of signal removing peptide sequence was 954bp. the gene was registered to GenBankand obtained the accession number Ana52569. the gene encodes a protein polypeptide containing 317 amino acids. It belongs to the Peptidase_C39_like superfamily, the theoretical molecular weight is about 35669.9Da. the isoelectric point is 5.92.pET-28a. after the recombinant plasmid was induced by IPTG, the protein was successfully expressed in Escherichia coli. The purified protein was detected by Western blotting and proved to be in accordance with the expected size. Conclusion the 27kDa CP gene was cloned successfully and the amino acid sequence and bioinformatics of CP gene and its encoding were obtained.
【作者單位】： 貴州醫(yī)科大學(xué)人體寄生蟲學(xué)教研室;
【基金】：貴州省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目(No.20143024)資助~~
【分類號】：R383

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