本文關(guān)鍵詞： 中介蝮 組織損傷 生物效應(yīng) 抗血清 中毒保護(hù)　出處：《陜西師范大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：中介蝮(Gloudius intermedius)屬蝰科(Viperidae)蝮亞科(Crotalinae)亞洲蝮屬(Gloydius),廣泛分布于我國西北、華北部分地區(qū),是我國6種蝮蛇中毒性最強(qiáng)的一種,它與分布區(qū)人民生活密切相關(guān)。蛇毒(snake venom)是蛇毒腺分泌的多種組分構(gòu)成的復(fù)雜混合物,分別作用于不同的靶分子／靶細(xì)胞,可能造成多種中毒效應(yīng),包括肌肉組織損傷、出血、水腫、血壓下降等。 早在1979年,趙爾宓等人的研究發(fā)現(xiàn),國產(chǎn)抗蝮蛇血清對中介蝮蛇毒沒有中和作用,發(fā)現(xiàn)中介蝮的蛇毒組成與其它5種蝮蛇(短尾蝮(G. brevicaudus)、高原蝮(G. strauchii)、黑眉蝮(G. saxitilis)、烏蘇里蝮(G. ussuriensis)及蛇島蝮(G. shedaoensis)〕蛇毒相比有較大差異。 由于中介蝮在北方分布廣泛,危害大,目前還沒有中介蝮蛇毒組織損傷方面的資料,加之缺乏特異性抗血清,這妨礙了蛇傷的有效治療。 研究內(nèi)容及方法： (1)中介蝮粗毒對小鼠的毒理學(xué)效應(yīng)及組織損傷,包括小鼠爪腫脹實(shí)驗(yàn),粗毒皮下注射小鼠后,對肌肉組織(心肌、骨骼肌)損傷的形態(tài)學(xué)觀察,大鼠尾靜脈注射引起肌肉損傷后肌酸激酶(CK)釋放檢測,兔耳靜脈注射后對血壓的影響； (2)抗蛇毒血清的制備及中毒保護(hù)效果,包括將中介蝮粗毒與弗氏佐劑混合乳化,將其作為抗原免疫新西蘭大白兔(初次免疫、5次加強(qiáng)免疫)后,收集兔抗血清,用免疫雙向擴(kuò)散法和間接ELISA法檢測抗血清的滴度和效價(jià),Western blot檢測抗原結(jié)合特異性； (3)抗血清的中毒保護(hù)作用：將制備的抗血清按一定比例分別與致死劑量的蛇毒在體外混合孵育后,腹腔注射小鼠(體重18-20g),24h后,根據(jù)小鼠存活率,計(jì)算抗血清對中介蝮蛇毒的解毒效應(yīng)。 結(jié)果及討論： (1)小鼠注射中介蝮蛇毒1.5小后,發(fā)現(xiàn)小鼠爪部開始有腫脹,3小時(shí)后出現(xiàn)明顯腫脹； (2)與對照組相比,小鼠腹腔注射中介蝮蛇毒12h后,骨骼肌中有部分肌原纖維被水解破壞,肌纖維排列無序,肌漿有溶解現(xiàn)象；心肌纖維排列無序,部分肌絲出現(xiàn)溶解,肌原纖維間隙加大,出現(xiàn)明顯損傷。 (3)尾靜脈注射中介蝮蛇毒后,在3h-6h CK活力逐漸上升,6h達(dá)最高(1.174U/mL),是注射前的7.2倍,之后逐漸下降；注射蛇毒后,血壓90min后呈快速下降趨勢,至120min時(shí),血壓已降至給藥前的40%以下,與同期生理鹽水組相比差異非常顯著(P0.01),這與國內(nèi)已經(jīng)報(bào)道的中介蝮咬傷人后的中毒癥狀相符。(4)瓊脂雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)顯示,抗體1：2、1：4、1：8倍稀釋后,可見明顯免疫沉淀線,表明在免疫接種第十五周時(shí),兔血液中已經(jīng)有高滴度的抗血清產(chǎn)生。 (5)ELISA檢測后發(fā)現(xiàn),抗血清的有效效價(jià)不低于1：128000；而抗體Western blotting檢測結(jié)果顯示,陽性反應(yīng)條帶主要針對分子量14.4kD-18.4kD之間、41kD部位、70kD左右3組毒素部位,表明主要毒素蛋白刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體。 (6)在體外中和后,兔抗血清為0.2mL以上時(shí),對0.76mg/kg中介蝮蛇毒有明顯的保護(hù)作用,一半以上的受試小鼠存活。可見抗血清能明顯延遲小鼠死亡時(shí)間,有解毒作用。 結(jié)論：本研究所得結(jié)果為將來開發(fā)抗中介蝮蛇毒血清,用于蛇傷治療奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:G.intermedius (Gloudius intermedius) (Viperidae) belongs to Viperidae Agkistrodon subfamily (Crotalinae) Gloydius (Gloydius), is widely distributed in Northwest China, North China, is one of 6 most toxic viper in our country, and it is closely related to the distribution of people's life in the area. The snake venom (snake venom) is the complex mixture of various groups of snake venom gland secretion, respectively for the target molecules / different target cells, may cause a variety of toxic effects, including muscle tissue injury, hemorrhage, edema, blood pressure decline.
In early 1979, Zhao Ermi et al study found that the domestic anti venom serum NO neutralization of venom, venom composition found intermedius and other 5 species of Agkistrodon brevicaudus (G. (brevicaudus) (G. strauchii), Agkistrodon strauchii (G. saxitilis), Agkistrodon saxatilis, Ussuri mamushi (G. and ussuriensis) Gloydius shedaoensis (G. shedaoensis) are quite different: compared to snake venom.
Because of g.intermedius wide distribution in northern China, the harm is great, there is no aspect of the venom tissue injury, and the lack of specific antiserum, which hinders the effective treatment of snakebites.
Research contents and methods:
(1) the toxicological effects of g.intermedius venom in mice and tissue injury, including mice paw swelling experiment, mice after subcutaneous injection of venom, muscle tissue (myocardium, skeletal muscle injury) to observe morphology, rat tail vein injection induced muscle damage after creatine kinase (CK) release assay, the effect on blood pressure after the injection of rabbit ear vein;
(2) the effect of preparation and poisoning protection of antivenom, including g.intermedius venom mixed with Freund's adjuvant emulsion, as antigen to immunize rabbits (initial immunization, 5 immunization) after collecting rabbit antiserum by double immune diffusion method and indirect ELISA method to detect the titer of antiserum and the titer of Western, detection of blot antigen binding specificity;
(3) poisoning the protective effects of antisera: the antiserum prepared according to a certain proportion respectively with a lethal dose of venom in vitro after incubation, intraperitoneal injection of mice (weight 18-20g), according to 24h, the survival rate of mice, calculation of detoxification effect on venom antiserum.
Results and discussions:
(1) after 1.5 small mice injected with Agkistrodon hutkkistrodon venom, it was found that the mouse claw began to swollen, and the swelling was obvious after 3 hours.
(2) compared with the control group, intraperitoneal injection of venom 12h, skeletal muscle in part by hydrolysis of myofibrillar damage, muscle fibers arranged disorderly, sarcoplasmic dissolution phenomenon; myocardial fibers arranged in disorder, part of myofilament dissolved, myofibril gap increased, the obvious damage.
(3) intravenous injection of venom increased gradually after the intermediary, the activity of CK in 3h-6h, 6h (1.174U/mL), the highest is 7.2 times before the injection, then decreased gradually; after the injection of venom, blood pressure decreased rapidly after 90min, to 120min, the blood pressure has dropped before administration of 40%, compared to compared with the normal saline group was significant difference (P0.01), and the symptoms of poisoning have been reported in the domestic g.intermedius bite after the match. (4) showed that agar double immunodiffusion test, 1:2,1:4,1:8 antibody dilution after immunoprecipitation showed that, at the fifteenth week after immunization, the rabbit blood has antiserum high titer.
(5) ELISA was found, the titer of antiserum effectively not less than 1:128000; and Western blotting antibody test results showed that the positive band mainly between molecular weight 14.4kD-18.4kD 41kD 70kD site, about 3 sets of toxin sites, showed that the main toxin stimulates the immune system to produce the corresponding antibody.
(6) in vitro after neutralization of rabbit antiserum is above 0.2mL, has obvious protective effect on 0.76mg/kg venom, more than half of the tested mice survival. Visible antiserum could obviously delay the death time of mice, detoxification.
Conclusion: the results of this study for the future development of anti venom serum for snakebite treatment laid the foundation.

【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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