本文關(guān)鍵詞： 間充質(zhì)干細(xì)胞 動員 缺氧 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 缺氧模擬劑 CoCl_2 去鐵胺 AMD3100 成纖維細(xì)胞集落形成單位 生物學(xué)特性　出處：《浙江大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第1章缺氧對間充質(zhì)干細(xì)胞的動員作用及機(jī)理研究 本部分研究首先建立了常壓缺氧誘導(dǎo)MSCs動員的動物模型,采用成纖維樣細(xì)胞集落形成培養(yǎng)法(CFU-F法)研究了缺氧不同時間(1-14天)對大鼠MSCs的動員作用。研究發(fā)現(xiàn)：短期缺氧可誘導(dǎo)大鼠MSCs動員進(jìn)入外周血。當(dāng)大鼠暴露于缺氧(10%O2濃度)環(huán)境中2天,外周血CFU-Fs即MSCs的數(shù)量開始顯著增加(5.80±0.58/3×106vs.1.40±0.24/3×106,P0.05)。隨著缺氧時間的延長,MSCs動員效率增加,呈時間依賴性。而缺氧并不影響大鼠骨髓CFU-Fs數(shù)量。我們采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫表型測定、三向分化能力檢測對缺氧動員外周血來源CFU-F細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：動員外周血來源細(xì)胞具有與骨髓MSCs相似的形態(tài)；表達(dá)CD90、CD29和CD44,而不表達(dá)造血系標(biāo)記CD45、CD34；經(jīng)誘導(dǎo)可分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞。以上結(jié)果說明缺氧動員外周血CFU-F細(xì)胞符合MSCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。 本部分對缺氧誘導(dǎo)MSCs動員的機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步研究。通過Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1α)在MSCs動員模型骨髓細(xì)胞表達(dá)升高。為進(jìn)一步明確HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)MSCs動員中的作用,我們采用HIF-1α的特異性抑制劑YC-1對HIF-1信號進(jìn)行阻斷。結(jié)果顯示：YC-(10mg/kg/d)顯著下調(diào)骨髓HIF-1α的表達(dá),同時明顯抑制了MSCs的動員。由此我們得出：HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)MSCs的動員中起關(guān)鍵作用。 本研究對轉(zhuǎn)錄因子HIF-1調(diào)控的下游基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)在MSCs動員中的作用進(jìn)行了探討。VEGF是受HIF-1直接調(diào)控的細(xì)胞生長因子,能促進(jìn)新生血管的形成、提高血管通透性。采用免疫組化與ELISA法檢測缺氧及對照各組骨髓組織及上清中VEGF的含量,結(jié)果顯示：缺氧2-7天,骨髓上清與骨髓組織中VEGF含量顯著增加。采用免疫組化方法對骨髓中血管內(nèi)皮生長因子受體3(VEGFR3)陽性的微血管進(jìn)行定量,發(fā)現(xiàn)：慢性缺氧(7天和14天)骨髓VEGFR3(+)的微血管數(shù)量明顯增加。SDF-1α在促進(jìn)MSCs遷移、誘導(dǎo)干細(xì)胞動員中起重要作用。ELISA檢測外周血中SDF-1α濃度發(fā)現(xiàn),大鼠外周血中SDF-1α濃度在缺氧2-14天較對照組顯著增加。遷移是MSCs動員的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。采用Transwell法測定MSCs的體外遷移能力示：SDF-1α(150ng/ml)能促進(jìn)MSCs的遷移,而在缺氧環(huán)境,MSCs遷移進(jìn)一步增加。以上結(jié)果說明HIF-1α下游基因VEGF與SDF-1α可能參與調(diào)控缺氧誘導(dǎo)MSCs動員。 本部分研究揭示了缺氧誘導(dǎo)MSCs動員的關(guān)鍵機(jī)制,為MSCs動員劑的研發(fā)提供了靶點與依據(jù)。 第2章缺氧模擬劑對間充質(zhì)干細(xì)胞的動員作用及機(jī)理研究 HIF-1信號通路在MSCs動員中關(guān)鍵作用的證實為MSCs動員劑的開發(fā)提供了思路。鐵螯合劑氯化鈷(CoCl2)和去鐵胺(Deferoxamine, DFX)可抑制常氧狀態(tài)下HIF-1α的降解,穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá),被稱為“缺氧模擬劑”。本部分實驗著重研究缺氧模擬劑CoCl2和去鐵胺對MSCs的動員作用并探討其相關(guān)機(jī)制。通過Western-blot檢測證實CoCl2能上調(diào)常氧環(huán)境培養(yǎng)的MSCs中HIF-1α蛋白表達(dá),在50、75μM時作用最為顯著。采用CFU-F法與流式細(xì)胞術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)CoCl210mg/kg/d連續(xù)給予7天,大鼠外周血CFU-Fs數(shù)量較對照組顯著增加(1.27±0.08vs.2.37±0.19CFU-Fs/ml, P0.05),且CD45-CD90+細(xì)胞群比例升高。同時骨髓CFU-Fs數(shù)量也明顯增加。以上結(jié)果說明：CoCl2(10mg/kg/d×7d)對大鼠MSCs具有動員作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CoCl2給予后,大鼠骨髓HIF-1α表達(dá)上調(diào),VEGF濃度增加。 我們檢測了缺氧模擬劑CoCl2聯(lián)合造血干細(xì)胞動員劑粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)與AMD3100對MSCs的動員作用。結(jié)果顯示：與對照組相比,單用G-CSF或AMD3100外周血中CFU-Fs數(shù)量并無明顯增加。與單用CoCl2組相比,CoCl2聯(lián)用G-CSF也不能增加MSCs的釋放。而CoCl2聯(lián)合AMD3100可以顯著增加MSCs動員效率(3.83±0.32vs.2.37±0.19CFU-Fs/ml, P0.05).流式細(xì)胞術(shù)檢測各組CD45-CD90+細(xì)胞群比例顯示,CoCl2給藥7天可以使外周血中CD45-CD90+細(xì)胞群比例升高,且總數(shù)增加(2.93±0.40vs.1.46±0.16×104/ml,P0.05),而CoCl2與AMD3100聯(lián)用后,大鼠外周血中CD45-CD90+細(xì)胞群比例與數(shù)量較CoCl2組進(jìn)一步增加。骨髓CFU-Fs檢測發(fā)現(xiàn)：CoCl2聯(lián)合AMD3100組骨髓CFU-Fs較單用CoCl2組顯著降低(13.8±1.07vs.18.4±1.50,P0.05)。以上結(jié)果表明：CoCl2聯(lián)合CXCR4抑制劑AMD3100可以增加MSCs動員效率。 另外,我們檢測了缺氧模擬劑DFX對小鼠外周血CD45-CD105+細(xì)胞群比例與數(shù)量的影響,發(fā)現(xiàn)：DFX可上調(diào)小鼠外周血中CD45-CD105+細(xì)胞群的比例,增加CD45-CD105+細(xì)胞的總數(shù)量。 第3章動員外周血來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究 本部分較為全面地研究了CoCl2聯(lián)合AMD3100動員外周血來源MSCs (PB-MSCs)與骨髓來源MSCs (BM-MSCs)的生物學(xué)特性。采用生長曲線測定發(fā)現(xiàn),PB-MSCs的生長具有與BM-MSCs相似的潛伏適應(yīng)期、對數(shù)生長期和平臺期,生長曲線呈“S”型。與BM-MSCs相比,PB-MSCs增殖速度較慢。細(xì)胞周期檢測顯示,PB-MSCs的S期細(xì)胞比例較BM-MSCs降低。以上結(jié)果說明：PB-MSCs增殖能力較弱于BM-BMCs。 流式細(xì)胞術(shù)檢測PB-MSCs及BM-MSCs的免疫表型,結(jié)果顯示PB-MSCs不表達(dá)造血系標(biāo)記CD45、CD34,而陽性表達(dá)CD44、CD29和CD90。以上幾個抗原在PB-MSCs表面表達(dá)情況與BM-MSCs相似。 我們采用形態(tài)學(xué)觀察、特異性染色及動態(tài)檢測分化相關(guān)基因表達(dá)來評估PB-MSCs的體外成骨、成脂分化潛能。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在成骨誘導(dǎo)第0、3、7天,成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2與成骨細(xì)胞特異性基因Bglap2在PB-MSCs中的mRNA表達(dá)均顯著高于BM-MSCs。Von Kossa染色示PB-MSCs有較多的鈣鹽沉積。在成脂分化第0天與第3天,脂肪細(xì)胞特異性基因Lpl在PB-MSCs中的mRNA表達(dá)低于BM-MSCs,而成脂分化調(diào)控特異性轉(zhuǎn)錄因子Pparg2mRNA表達(dá)水平在PB-MSCs中各個時間點均顯著低于BM-MSCs。油紅O染色示PB-MSCs中分化陽性細(xì)胞比例較低。以上結(jié)果表明：與BM-MSCs相比,PB-MSCs具有較強(qiáng)的成骨分化能力,而成脂分化能力較弱。體外高密度微團(tuán)培養(yǎng)法及甲苯胺藍(lán)染色檢測成軟骨分化潛能發(fā)現(xiàn),PB-MSCs與BM-MSCs具有相似的成軟骨分化潛能。經(jīng)β-巰基乙醇體外誘導(dǎo),PB-MSCs可以分化為Nestin(+)的神經(jīng)元樣細(xì)胞,分化能力與BM-MSCs相當(dāng)。 采用Transwell法檢測PB-MSCs的遷移能力,發(fā)現(xiàn)PB-MSCs對趨化因子SDF-1α的遷移能力低于BM-MSCs(46.0±4.74vs.70.4±4.51/200×,P0.05)。ELISA檢測旁分泌功能,結(jié)果顯示與BM-MSCs相比,PB-MSCs分泌VEGF顯著增加(6935.6±617.2vs.2068.7±243.2ng/ml,P0.05),而分泌IGF、IL-6減少。 綜上,我們得出以下結(jié)論：(1)短期缺氧可以誘導(dǎo)MSCs動員,隨著缺氧時間的延長,MSCs動員效率增加,呈時間依賴性；(2)HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)MSCs的動員中起關(guān)鍵作用；(3)HIF-1α可能通過其下游基因VEGF與SDF-1α調(diào)控缺氧誘導(dǎo)MSCs的動員；(4)CoCl2可以穩(wěn)定大鼠骨髓HIF-1α表達(dá),上調(diào)VEGF;(5) CoCl2(10mg/kg/d×7d)對大鼠MSCs具有動員作用,且增加骨髓MSCs的數(shù)量；(6)COC12聯(lián)合CXCR4抑制劑AMD3100可以增加大鼠MSCs動員效率；(7)去鐵胺可增加小鼠外周血中CD45-CD105+細(xì)胞群的比例與數(shù)量；(8)動員外周血來源MSCs在體外培養(yǎng)下具有一定的增殖潛能、多向分化能力、遷移能力與旁分泌功能,但與BM-MSCs間存在差異。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1503070