發(fā)布時間：2018-01-29 13:37

  本文關鍵詞： 微小RNA 靶基因 腫瘤遷移 前體miRNA 微小RNA加工 多聚腺苷酸 體內(nèi)轉錄 加速 外源基因　出處：《廣西醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：miRNA為一類非編碼小RNA，約22nt的單鏈核苷酸，能夠通過轉錄后調(diào)控抑制靶基因的表達，進而參與各種生命活動。在細胞核中，miRNA最初由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉錄生成原初轉錄物pri-miRNA，然后由核糖核酸酶Ⅲ Drosha和DGCR8（DiGeorge cirtical region8）構成的復合物microprocessor進行識別切割，生成約60-70nt的前體miRNA（pre-miRNA）。Exportin-5識別pre-miRNA上約2nt的3'突出末端，通過Ran-GTP依賴機制將pre-miRNA轉運至細胞質(zhì)[1][2]。在細胞質(zhì)中，另一個核糖核酸酶Ⅲ Dicer將pre-miRNA切割成22nt的miRNA雙鏈，即miRNA/miRNA*。通常雙鏈中有一條鏈（即miRNA）生成成熟的miRNA指導鏈，，選擇性與AGO家族的蛋白結合形成miRISC，作用于靶mRNA的3’UTR，從而導致靶基因mRNA的降解或通過降低靶基因的穩(wěn)定性從而抑制靶基因翻譯，降低靶基因蛋白的表達水平。而另一條鏈miRNA*通常被降解。 在不同細胞、組織、器官的生長發(fā)育過程中，miRNA的表達譜有很大差異。它們與許多生理病理過程密切相關，如生長發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、脂類代謝、激素分泌、腫瘤形成和病毒感染等[3][4][5]。一個特異的miRNA可以靶向幾百個靶基因，而一個靶基因也可以由不同的miRNA進行調(diào)控。最近，眾多報導顯示，miRNA能夠影響細胞的多種功能，并參與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤細胞中miRNA的表達水平普遍較低，miRNA在腫瘤細胞中可以作為癌miRNA或者抑癌miRNA出現(xiàn)，而miR-138通常作為抑癌miRNA發(fā)揮生物學功能。目前，研究miR-138功能主要聚焦在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移、細胞分化、DNA損傷以及疾病相關性等方面。 在世界范圍內(nèi)，子宮頸癌居女性惡性腫瘤的第二位；在女性與腫瘤相關的死因中，子宮頸癌亦居第二位。目前，通過檢測子宮頸癌的miRNA表達譜，試圖從中尋找特異的生物標志物的方法已成為子宮頸癌治療的方向之一。具體方法為研究特異miRNA及其功能性靶基因與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的關系，從而找到可供治療的關鍵潛在靶標分子。文獻報道，在宮頸癌HeLa細胞中，僅存在miR-138的前體miRNA，而幾乎檢測不到miR-138成熟體，提示miR-138可能與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關聯(lián)。 本論文的研究目的在于過表達miR-138并檢測其在HeLa細胞中的生物學意義。尋找及鑒定miR-138的靶基因，并進一步研究其在HeLa細胞中的生物學功能。研究內(nèi)容分為以下四方面： 1.miR-138靶向RMND5A的預測及驗證。通過生物信息學軟件TargetScan5.2預測miR-138的最高分值靶基因為RMND5A，然后通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miR-138對RMND5A3’UTR的兩個靶位點具有直接抑制作用，在HeLa細胞中轉染miR-138mimics也導致RMND5A基因的mRNA和蛋白水平下降，以上結果說明，miR-138能夠直接靶向RMND5AmRNA的3’UTR，降低RMND5A的mRNA水平和蛋白水平。 同時，在HepG2、H460、H1299、H4100等腫瘤細胞中轉染miR-138mimics后也能夠顯著下調(diào)RMND5A的mRNA表達水平，說明在多種腫瘤細胞中，miR-138都能夠靶向RMND5A，并有可能參與各種腫瘤細胞的生物學過程。 2.miR-138通過靶向RMND5A進而促進Exportin-5蛋白降解。RMND5A能夠與RanBPM相結合，而RanBPM能夠與Ran相結合，Ran屬于Ras超家族成員之一的小GTP酶結合蛋白，對RNA和蛋白通過核孔復合物至關重要。因此， RMND5A可能參與前體miRNA出核的重要過程，我們通過免疫共沉淀的方法鑒定出RMND5A與Exportin-5在體外能夠相互結合，而Exportin-5為介導前體miRNA出核的關鍵分子。敲低HeLa細胞內(nèi)的RMND5A之后，Exportin-5蛋白表達也受到抑制，而mRNA水平并未受影響，說明RMND5A并不影響Exportin-5的轉錄水平。同時，發(fā)現(xiàn)轉染siRMND5A的HeLa細胞在放線菌酮作用下，Exportin-5的半衰期明顯變短，進而推測RMND5A可能通過與Exportin-5的相互結合作用而阻止其蛋白降解。 3.miR-138通過靶向RMND5A進而抑制前體miRNA出核并降低整體miRNA水平。由第二部分的實驗結果，我們推測RMND5A與Exportin-5的相互作用會對細胞核和細胞質(zhì)中的前體miRNA分布以及對細胞中整體miRNA水平有影響，我們通過在HeLa細胞中轉染miR-138mimics或RMND5A siRNA，分別隨機檢測細胞核和細胞質(zhì)中的前體miRNA（包括pre-miR-105/19a/7-1/7-2/7-3/128-1/93/30a/17/107/138-1/23a/128-2/124-3/142）水平以及細胞中相應miRNA的整體水平，發(fā)現(xiàn)在轉染miR-138mimics和RMND5A siRNA的情況下，前體miRNA的核質(zhì)分布比例大于對照組，并且細胞中相對應的miRNA水平下降。同時，miRNA芯片結果顯示轉染了miR-138mimics后的HeLa細胞中至少有75種miRNA下調(diào)，進一步驗證了miR-138作用于miRNA的普遍性。這說明，miR-138能夠靶向RMND5A進而阻滯前體miRNA出核并導致部分miRNA水平下降。同時，我們發(fā)現(xiàn)被下調(diào)的miRNA中大部分miRNA與細胞遷移能力相關，它們的潛在靶基因具有抑制或促進細胞遷移的能力。 4.miR-138通過靶向RMND5A抑制HeLa細胞遷移。在HeLa細胞中轉染miR-138mimics和RMND5A siRNA均可以抑制HeLa細胞劃痕修復能力和遷移能力。結果提示，miR-138能夠作為一個抑癌miRNA，抑制宮頸癌HeLa細胞的遷移。 綜上所述，我們首次預測并鑒定了miR-138在HeLa細胞中可以靶向RMND5A，發(fā)現(xiàn)了RMND5A通過與Exportin-5的相互作用抑制后者蛋白降解的新功能。過表達miR-138可以降低RMND5A水平，促進Exportin-5蛋白降解，從而抑制前體miRNA的出核并降低miRNA整體水平，進而表現(xiàn)為對HeLa細胞遷移能力的抑制。 在mRNA的3’末端通常含有多聚腺苷酸，其在調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、轉錄效率及出核中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)在MCF-7細胞中，依賴于H1啟動子體內(nèi)轉錄的多聚腺苷酸能夠加速外源綠色熒光蛋白(GFP)mRNA從細胞核向細胞質(zhì)輸出。利用此方法，我們對外源p53基因的表達也觀察到了類似的結果。我們的研究結果表明，通過體內(nèi)轉錄多聚腺苷酸從而加速外源基因在細胞內(nèi)的表達策略，可能對基因療法或快速研究某個特異基因的功能具有重要的意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R341

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本文編號：1473539