本文關(guān)鍵詞： 微小RNA 靶基因 腫瘤遷移 前體miRNA 微小RNA加工 多聚腺苷酸 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄 加速 外源基因　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：miRNA為一類非編碼小RNA，約22nt的單鏈核苷酸，能夠通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與各種生命活動(dòng)。在細(xì)胞核中，miRNA最初由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成原初轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA，然后由核糖核酸酶Ⅲ Drosha和DGCR8（DiGeorge cirtical region8）構(gòu)成的復(fù)合物microprocessor進(jìn)行識別切割，生成約60-70nt的前體miRNA（pre-miRNA）。Exportin-5識別pre-miRNA上約2nt的3'突出末端，通過Ran-GTP依賴機(jī)制將pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)[1][2]。在細(xì)胞質(zhì)中，另一個(gè)核糖核酸酶Ⅲ Dicer將pre-miRNA切割成22nt的miRNA雙鏈，即miRNA/miRNA*。通常雙鏈中有一條鏈（即miRNA）生成成熟的miRNA指導(dǎo)鏈，，選擇性與AGO家族的蛋白結(jié)合形成miRISC，作用于靶mRNA的3’UTR，從而導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或通過降低靶基因的穩(wěn)定性從而抑制靶基因翻譯，降低靶基因蛋白的表達(dá)水平。而另一條鏈miRNA*通常被降解。 在不同細(xì)胞、組織、器官的生長發(fā)育過程中，miRNA的表達(dá)譜有很大差異。它們與許多生理病理過程密切相關(guān)，如生長發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、脂類代謝、激素分泌、腫瘤形成和病毒感染等[3][4][5]。一個(gè)特異的miRNA可以靶向幾百個(gè)靶基因，而一個(gè)靶基因也可以由不同的miRNA進(jìn)行調(diào)控。最近，眾多報(bào)導(dǎo)顯示，miRNA能夠影響細(xì)胞的多種功能，并參與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平普遍較低，miRNA在腫瘤細(xì)胞中可以作為癌miRNA或者抑癌miRNA出現(xiàn)，而miR-138通常作為抑癌miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能。目前，研究miR-138功能主要聚焦在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化、DNA損傷以及疾病相關(guān)性等方面。 在世界范圍內(nèi)，子宮頸癌居女性惡性腫瘤的第二位；在女性與腫瘤相關(guān)的死因中，子宮頸癌亦居第二位。目前，通過檢測子宮頸癌的miRNA表達(dá)譜，試圖從中尋找特異的生物標(biāo)志物的方法已成為子宮頸癌治療的方向之一。具體方法為研究特異miRNA及其功能性靶基因與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而找到可供治療的關(guān)鍵潛在靶標(biāo)分子。文獻(xiàn)報(bào)道，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，僅存在miR-138的前體miRNA，而幾乎檢測不到miR-138成熟體，提示miR-138可能與子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)。 本論文的研究目的在于過表達(dá)miR-138并檢測其在HeLa細(xì)胞中的生物學(xué)意義。尋找及鑒定miR-138的靶基因，并進(jìn)一步研究其在HeLa細(xì)胞中的生物學(xué)功能。研究內(nèi)容分為以下四方面： 1.miR-138靶向RMND5A的預(yù)測及驗(yàn)證。通過生物信息學(xué)軟件TargetScan5.2預(yù)測miR-138的最高分值靶基因?yàn)镽MND5A，然后通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-138對RMND5A3’UTR的兩個(gè)靶位點(diǎn)具有直接抑制作用，在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138mimics也導(dǎo)致RMND5A基因的mRNA和蛋白水平下降，以上結(jié)果說明，miR-138能夠直接靶向RMND5AmRNA的3’UTR，降低RMND5A的mRNA水平和蛋白水平。 同時(shí)，在HepG2、H460、H1299、H4100等腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138mimics后也能夠顯著下調(diào)RMND5A的mRNA表達(dá)水平，說明在多種腫瘤細(xì)胞中，miR-138都能夠靶向RMND5A，并有可能參與各種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程。 2.miR-138通過靶向RMND5A進(jìn)而促進(jìn)Exportin-5蛋白降解。RMND5A能夠與RanBPM相結(jié)合，而RanBPM能夠與Ran相結(jié)合，Ran屬于Ras超家族成員之一的小GTP酶結(jié)合蛋白，對RNA和蛋白通過核孔復(fù)合物至關(guān)重要。因此， RMND5A可能參與前體miRNA出核的重要過程，我們通過免疫共沉淀的方法鑒定出RMND5A與Exportin-5在體外能夠相互結(jié)合，而Exportin-5為介導(dǎo)前體miRNA出核的關(guān)鍵分子。敲低HeLa細(xì)胞內(nèi)的RMND5A之后，Exportin-5蛋白表達(dá)也受到抑制，而mRNA水平并未受影響，說明RMND5A并不影響Exportin-5的轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRMND5A的HeLa細(xì)胞在放線菌酮作用下，Exportin-5的半衰期明顯變短，進(jìn)而推測RMND5A可能通過與Exportin-5的相互結(jié)合作用而阻止其蛋白降解。 3.miR-138通過靶向RMND5A進(jìn)而抑制前體miRNA出核并降低整體miRNA水平。由第二部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測RMND5A與Exportin-5的相互作用會對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的前體miRNA分布以及對細(xì)胞中整體miRNA水平有影響，我們通過在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138mimics或RMND5A siRNA，分別隨機(jī)檢測細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的前體miRNA（包括pre-miR-105/19a/7-1/7-2/7-3/128-1/93/30a/17/107/138-1/23a/128-2/124-3/142）水平以及細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的整體水平，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染miR-138mimics和RMND5A siRNA的情況下，前體miRNA的核質(zhì)分布比例大于對照組，并且細(xì)胞中相對應(yīng)的miRNA水平下降。同時(shí)，miRNA芯片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR-138mimics后的HeLa細(xì)胞中至少有75種miRNA下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-138作用于miRNA的普遍性。這說明，miR-138能夠靶向RMND5A進(jìn)而阻滯前體miRNA出核并導(dǎo)致部分miRNA水平下降。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)被下調(diào)的miRNA中大部分miRNA與細(xì)胞遷移能力相關(guān)，它們的潛在靶基因具有抑制或促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力。 4.miR-138通過靶向RMND5A抑制HeLa細(xì)胞遷移。在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-138mimics和RMND5A siRNA均可以抑制HeLa細(xì)胞劃痕修復(fù)能力和遷移能力。結(jié)果提示，miR-138能夠作為一個(gè)抑癌miRNA，抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移。 綜上所述，我們首次預(yù)測并鑒定了miR-138在HeLa細(xì)胞中可以靶向RMND5A，發(fā)現(xiàn)了RMND5A通過與Exportin-5的相互作用抑制后者蛋白降解的新功能。過表達(dá)miR-138可以降低RMND5A水平，促進(jìn)Exportin-5蛋白降解，從而抑制前體miRNA的出核并降低miRNA整體水平，進(jìn)而表現(xiàn)為對HeLa細(xì)胞遷移能力的抑制。 在mRNA的3’末端通常含有多聚腺苷酸，其在調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄效率及出核中發(fā)揮重要作用。我們發(fā)現(xiàn)在MCF-7細(xì)胞中，依賴于H1啟動(dòng)子體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的多聚腺苷酸能夠加速外源綠色熒光蛋白(GFP)mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)輸出。利用此方法，我們對外源p53基因的表達(dá)也觀察到了類似的結(jié)果。我們的研究結(jié)果表明，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)錄多聚腺苷酸從而加速外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)策略，可能對基因療法或快速研究某個(gè)特異基因的功能具有重要的意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R341

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本文編號：1473539