本文關(guān)鍵詞： 低強(qiáng)度脈沖超聲 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 骨髓有核細(xì)胞 細(xì)胞增殖　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）和骨髓有核細(xì)胞均來源于骨髓，對醫(yī)學(xué)的發(fā)展起著非常重要的作用，現(xiàn)已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨髓來源細(xì)胞的一種，具有取材方便，體外易培養(yǎng)，增殖快等優(yōu)點，被認(rèn)為是組織工程學(xué)中修復(fù)和替換病損組織和器官、以及功能重建理想的種子細(xì)胞。但是目前種子細(xì)胞數(shù)量不足，體外常規(guī)擴(kuò)增無法滿足臨床研究及組織工程學(xué)產(chǎn)業(yè)化需求，這極大地制約其發(fā)展。骨髓有核細(xì)胞作為骨髓中的主要成份，對人體造血、免疫等有重要作用，當(dāng)骨髓有核細(xì)胞減少或者增生低下時，會引起嚴(yán)重的血液、免疫系統(tǒng)疾病。 由此可見骨髓來源細(xì)胞不足或者增生低下時，對人體多個組織器官系統(tǒng)會產(chǎn)生極大的影響。目前很多學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些促進(jìn)骨髓來源細(xì)胞增殖的方法和藥物，但都存在不完善之處。因此，尋求一種更安全、更有效的技術(shù)手段以獲得足夠數(shù)量、具有再生活力的骨髓來源細(xì)胞已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中急需解決的關(guān)鍵問題。 近年來，低強(qiáng)度脈沖超聲（Low-Intensity Pulsed Ultrasound, LIPUS）作為一種安全的純“綠色”物理技術(shù)手段，具有操作安全簡便、費用低廉等特點。目前，已應(yīng)用于臨床骨與軟組織創(chuàng)傷的愈合，使用安全，已經(jīng)取得顯著效果。前期實驗初步探究了LIPUS促進(jìn)BMSCs增殖的可行性。由此，本課題在前期實驗的基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究，并著眼于骨髓，將LIPUS分別作用于離體BMSCs和活體兔骨髓有核細(xì)胞，進(jìn)一步探索能否找到擴(kuò)增骨髓來源細(xì)胞的新途徑。 目的 1.觀察不同參數(shù)的低強(qiáng)度脈沖超聲對體外分離培養(yǎng)的BMSCs增殖的影響，篩選能提高BMSCs增殖效率的適宜的低強(qiáng)度脈沖超聲參數(shù)。 2.進(jìn)一步驗證適宜參數(shù)LIPUS對體外分離培養(yǎng)BMSCs增殖效應(yīng)的影響，探討LIPUS促進(jìn)BMSCs增殖的有效性和安全性。 3.觀察LIPUS對活體兔骨髓來源有核細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，初步探討LIPUS在促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞增殖方面的作用。 方法 1.為篩選后續(xù)研究適宜的LIPUS參數(shù)，實驗選用頻率為0.6MHz，強(qiáng)度為0.03、0.1、0.2、0.3W/cm2的LIPUS分別輻照體外培養(yǎng)的第三代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5、10、15、20、30min，各參數(shù)組輻照一次，24h后倒差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法和流式細(xì)胞儀檢測LIPUS輻照后細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞周期。 2.將體外分離培養(yǎng)的第三代BMSCs隨機(jī)分為2組：LIPUS輻照組和對照組。采用前期實驗篩選出的適宜參數(shù)0.2W/cm2，10min進(jìn)行輻照，連續(xù)輻照8d。輻照后每天鏡下觀察細(xì)胞生長情況、四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期及增殖指數(shù)（PI）。 3.將120只新西蘭大白兔隨機(jī)分為LIPUS組、自身對照組和正常組。LIPUS連續(xù)輻照5d后，分別于輻照前，輻照5d后⑴每天觀察兔的生長情況；⑵第6d、8d、10d、12d進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計數(shù)、觀察骨髓增生程度變化；⑶輻照處進(jìn)行皮膚、肌肉組織病理切片。 結(jié)果 1．各參數(shù)組經(jīng)過LIPUS輻照后24h觀察細(xì)胞分裂增殖均較空白對照組明顯活躍，細(xì)胞集落更為密集。細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯高于空白對照組（P0.05），其中以0.2W/cm2,10min輻照后促進(jìn)增殖效果最為顯著。 2. LIPUS能夠明顯促進(jìn)BMSCs增殖，LIPUS組于輻照后各天細(xì)胞分裂增殖活性較對照組明顯活躍，細(xì)胞集落更為密集；MTT法檢測LIPUS組于輻照前、輻照后1d、3d、5d、7d的細(xì)胞增殖活性均明顯高于對照組（P0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖指數(shù)提示LIPUS組于輻照后各天均明顯高于對照組（P0.05）。 3.輻照5d后每天觀察兔的生活習(xí)慣與正常組比較，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。LIPUS組輻照5d后，6d、8d的骨髓增生程度、骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯高于自身對照組和正常組（P0.05）。自身對照組骨髓有核細(xì)胞數(shù)與正常組比較，沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P0.05）。輻照處的皮膚和肌肉組織病理切片：LIPUS輻照后皮膚表皮及真皮層均未見異常，肌肉紋理清晰，染色較淺，其內(nèi)均未見炎性細(xì)胞。 結(jié)論 1. LIPUS對體外分離培養(yǎng)的BMSCs增殖具有明顯的促進(jìn)作用。 2. LIPUS輻照一定時間后能夠促進(jìn)BMSCs增殖，其中強(qiáng)度為0.2W/cm2，輻照10min劑量促進(jìn)增殖效率最佳。 3. LIPUS對活體兔骨髓來源有核細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。并且可能是一種較為安全有效的技術(shù)方法。
[Abstract]:Bone Mesenchymal Stem Cells (BMSCs) and bone marrow nucleated cells are all derived from bone marrow. They play a very important role in the development of medicine, and have become a research focus in the field of medicine.
Bone marrow mesenchymal stem cells as a source of bone marrow cells, it is a convenient, easily cultured in vitro, the advantages of rapid proliferation, is considered to be the replacement and repair of damaged tissues and organs in tissue engineering, seed cells and functional reconstruction of the ideal. But at present insufficient number of seed cells, in vitro amplification can not meet the clinical research and tissue engineering industrialization needs, which greatly restricts its development. As the main component of bone marrow mononuclear cells in the bone marrow, on human hematopoiesis, immunity plays an important role, when the bone marrow nucleated cells to reduce or increase students' low, will cause serious blood diseases of the immune system.
This lack of bone marrow cells or low proliferation, multiple organ system will greatly influence. Many scholars have found some methods to promote the proliferation of bone marrow cells and drugs, but are not perfect. Therefore, to seek a safer and more effective techniques to obtain a sufficient number of bone marrow derived cells, with regeneration has become a key problem needs to be solved urgently in medical research.
In recent years, the low intensity pulsed ultrasound (Low-Intensity Pulsed, Ultrasound, LIPUS) as a kind of pure "green" physical security technology, has the characteristics of simple and safe operation, low cost and so on. At present, has been applied to clinical healing of bone and soft tissue trauma, safe use, have achieved remarkable results. The preliminary inquiry the feasibility of LIPUS to promote the proliferation of BMSCs. Therefore, this topic further research based on the previous experiment, and focus on the bone marrow, LIPUS were exposed to BMSCs in vitro and in vivo rabbit bone marrow nucleated cells, further exploration can find a new way of expansion of bone marrow cells.
objective
1., we observed the effect of low intensity pulsed ultrasound with different parameters on the proliferation of BMSCs in vitro, and screened suitable low intensity pulsed ultrasound parameters that could increase BMSCs proliferation efficiency.
2. to further verify the effect of the suitable parameter LIPUS on the proliferation of BMSCs in vitro, and to explore the effectiveness and safety of LIPUS to promote the proliferation of BMSCs.
3. the effect of LIPUS on the proliferation of nucleated cells from bone marrow of living rabbits was observed, and the effect of LIPUS on the proliferation of bone marrow nucleated cells was preliminarily investigated.
Method
The 1. parameter selection for LIPUS follow-up study for the frequency selection experiment for 0.6MHz, intensity of 0.03,0.1,0.2,0.3W/cm2 LIPUS respectively in vitro irradiation of the third generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells 5,10,15,20,30min, each array irradiation time, 24h inverted contrast microscope to observe cell growth, four methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method flow cytometry and LIPUS after irradiation, cell proliferation and cell cycle.
2. the third generation of BMSCs cultured in vitro were randomly divided into 2 groups: LIPUS groups and control groups. The optimal parameters of 0.2W/cm2,10min irradiation experiment screened by continuous irradiation after irradiation with 8D. every day under the microscope to observe the cell growth, cell proliferation activity of four methyl thiazolyl tetrazolium assay; cell cycle and proliferation index of flow cytometry (PI).
3. 120 New Zealand white rabbits were randomly divided into LIPUS group, control group and normal group.LIPUS 5D after continuous irradiation, respectively before irradiation after irradiation was observed every day after 5D growth of rabbits; the 6D, 8D, 10d, 12D, bone marrow nucleated cell count, observe the change of the degree of bone marrow hyperplasia; irradiation skin, muscle tissue pathological sections.
Result
1. the parameter array after LIPUS irradiation on 24h cell proliferation were significantly more active than the control group, cell colony was more intensive. The index of cell proliferation activity and cell proliferation were significantly higher than control group (P0.05), of which 0.2W/cm2,10min after irradiation can promote the proliferation of the most significant effect.
2. LIPUS can significantly promote the proliferation of BMSCs in group LIPUS after irradiation the cell proliferation activity compared to the control group was active, the colony was more intensive; MTT assay in LIPUS group before irradiation, irradiation after 1D, 3D, 5D, cell proliferation activity of 7D were significantly higher than the control group (P0.05); cell the proliferation index of flow cytometry showed that LIPUS group in the days after irradiation were significantly higher than the control group (P0.05).
The 3. day after irradiation 5D habits compared with the normal group of rabbits, no obvious abnormality in group.LIPUS irradiation after the discovery of 5D, 6D, 8D and the degree of bone marrow hyperplasia, bone marrow nucleated cell number was significantly higher than that of the control group and normal group (P0.05). The control group the number of bone marrow cells and normal groups. No statistically significant difference (P0.05). The skin and muscle tissue pathological sections at LIPUS after irradiation irradiation: skin epidermis and dermis showed no abnormality of muscle, texture clear, lighter staining, in which there was no inflammatory cell.
conclusion
1. LIPUS has an obvious promoting effect on the proliferation of BMSCs in vitro.
2. LIPUS can promote the proliferation of BMSCs after a certain time, of which the intensity is 0.2W/cm2, and the dose of irradiated 10min is the best to promote the proliferation efficiency.
3. LIPUS can promote the proliferation of nucleated cells from the bone marrow of living rabbits, and may be a safer and more effective technique.

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1473271