本文關鍵詞： 鼠疫耶爾森氏菌 YopK MATN2 致病機制 病原與宿主相互作用　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)引起的一種自然疫源性烈性傳染病,曾經(jīng)引起數(shù)以億計的人死亡,造成人類歷史上巨大的災難。鼠疫是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病,我國鼠疫自然疫源地分布廣泛,占國土面積的15%左右,且上世紀90年代以來疫區(qū)動物鼠疫流行面積不斷擴大,人間鼠疫病例呈上升態(tài)勢,因此鼠疫的防治對我國經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定依然具有非常重要的意義。 Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是革蘭氏陰性菌中普遍存在的重要毒力機制,在細菌感染宿主細胞時能向宿主細胞內(nèi)靶向轉運效應蛋白,并抑制和調控宿主的天然免疫響應機制。鼠疫菌的pCD1質粒編碼的T3SS是由二十多個蛋白構成的分泌裝置,其效應蛋白稱為Yops(Yersinia outer membrane protein)。Yops經(jīng)T3SS被輸送到真核細胞內(nèi)或細胞外間質,通過干擾宿主細胞的天然免疫功能包括抑制宿主機體的炎癥反應、抑制非特異性的免疫保護、使菌體免受吞噬細胞的吞噬和殺傷等作用得以存活和增殖,進而建立持續(xù)感染。YopK是鼠疫菌效應蛋白之一,研究表明YopK與鼠疫菌的毒力相關,但是其作用機制仍然不明確。在本室前期工作中,利用酵母雙雜交技術篩選到鼠疫菌T3SS的效應蛋白YopK與人蛋白MATN2(Matrilin-2)存在相互作用。MATN2是細胞外絲纖維狀網(wǎng)絡結構的重要組成成分,與膠原蛋白I、膠原蛋白IV、原纖維蛋白-2、纖維連接蛋白等蛋白組成的復合物結合,尚未有研究報道它與微生物致病機制相關。本研究旨在深入研究YopK對鼠疫菌毒力的影響,驗證YopK與人蛋白MATN2的相互作用及其對鼠疫菌致病性的貢獻,促進我們進一步深入了解鼠疫菌的致病機制。本研究首先利用λ-Red重組系統(tǒng)構建鼠疫菌201株的yopK基因突變株即?yopK,在突變株基礎上利用低拷貝質粒pACYC184為載體,構建了yopK基因互補株。經(jīng)過特異性PCR檢測和免疫印記實驗結果證實鼠疫菌?yopK和互補株構建成功。我們用鼠疫菌野生株201株和?yopK、互補株感染BALB/c小鼠觀察YopK與鼠疫菌毒力之間的關系。LD50結果顯示,鼠疫菌?yopK株靜脈注射途徑攻毒時毒力顯著下降(201株LD50=31cfu,?yopK LD50=1380cfu),互補株恢復毒力(LD50=89cfu),而經(jīng)皮下途徑感染時毒力沒有顯著變化。我們將鼠疫201株和?yopK通過尾靜脈注射途徑感染BALB/c小鼠,于感染后24,48和72小時取動物的肝臟、脾臟和肺臟,采用臟器研磨、適當稀釋后涂平板計數(shù)的方法進行臟器的細菌載量測定。結果顯示在肝、脾、肺中,鼠疫菌野生株數(shù)量顯著高于yopK突變株,72小時后?yopK攻擊的小鼠已經(jīng)開始進入感染的恢復階段,即細菌的載量呈現(xiàn)下降趨勢。在同一時間點,不論是野生型鼠疫菌還是yopK菌株,其載量都是在肝臟中最多,其次是脾臟,肺臟中最少。 本研究還純化了YopK蛋白,并制備了YopK蛋白的特異性抗體,用以分析YopK感染宿主細胞后的定位,即YopK能否被轉運到宿主細胞內(nèi)。我們利用細胞裂解組分免疫印記分析的方法檢測鼠疫菌野生株和?yopK感染HeLa細胞后YopK蛋白的定位情況。結果顯示鼠疫菌野生株感染的細胞培養(yǎng)基上清和細胞裂解后的沉淀中均存在YopK蛋白,但是在HeLa細胞裂解液上清中卻不能檢測到YopK的條帶,說明YopK可以被鼠疫菌的T3SS轉運到菌體外從而進入了細胞培養(yǎng)基上清,但是不能轉運到宿主細胞中,即YopK主要存在于宿主細胞外。這一結果提示我們,YopK可能在宿主的粘附和入侵階段發(fā)揮其毒性作用。因此,我們繼續(xù)分析yopK基因突變對HeLa細胞的粘附和抗小鼠巨噬細胞RAW264.7的吞噬能力的影響。我們用感染HeLa細胞作為鼠疫菌粘附宿主上皮的細胞模型,并加入細胞松弛素D抑制細胞內(nèi)吞作用,用野生菌株和?yopK感染HeLa細胞并用鼠疫菌特異性抗體對鼠疫菌進行熒光標記,然后用流式細胞儀分析HeLa細胞粘附鼠疫菌的情況。結果顯示,yopK突變株對HeLa細胞的粘附能力顯著下降。用同樣的分析手段,我們分析了YopK對鼠疫菌被RAW264.7細胞吞噬的影響。結果顯示,?yopK被RAW264.7的吞噬百分比與野生型菌株相比沒有明顯的變化。這一結果證實了我們的假設,即YopK與鼠疫菌與宿主細胞的粘附相關。鼠疫菌在感染的早期階段需要粘附并被巨噬細胞吞噬,逃避宿主的免疫監(jiān)視和清除作用,并在宿主巨噬細胞內(nèi)大量的繁殖。在胞內(nèi)繁殖階段,鼠疫菌的F1抗原、pH6抗原等毒力因子開始大量表達,使鼠疫菌獲得了在細胞外生存的能力。因此我們認為YopK可能在鼠疫菌感染的早期階段發(fā)揮重要作用。 本研究初步探討了YopK和MATN2的相互作用與致病機制之間的關系。MATN2是matrilins家族(包括MATN1-4)最大的成員,全長956aa,分子量約10萬Da。MATN2前23aa編碼信號肽,包含2個類似vWFA的結構域,中間由10個EGF模塊連接。我們以人cDNA為模板,構建了MATN2的pCMV-Myc表達載體,及其截短體,并成功的在293細胞中瞬時表達這些蛋白。首先我們通過GST- pull down技術證實了YopK與人蛋白MATN2之間確實存在著體外相互作用。MATN2截短體與MATN2的GST- pull down分析確定MATN2與YopK蛋白結合的部位位于MATN2的574-903位氨基酸,對應于后2個EGF結構域和vWA結構域,而該vWA結構域中存在一個MIDAS (metal ion dependent adhesion site,金屬離子依賴的黏附位點)模體,序列為DXSXSXnTXnD。因此,我們構建了MATN2在MIDAS的三個關鍵氨基酸位點的突變體,GST- pull down分析顯示三個突變體與YopK蛋白均存在相互作用,三個位點的突變體不影響YopK與MATN2的結合。我們還將進一步研究YopK和MATN2的相互作用的機制及其生理學意義。 本研究結果表明,YopK與鼠疫菌與宿主細胞的粘附密切相關。YopK與MATN2存在相互作用,并且這種相互作用的存在是MATN2的vWA2結構域所介導的。我們還將深入研究YopK蛋白與MATN2的相互作用與YopK影響宿主細胞粘附功能之間是否有聯(lián)系,為揭示鼠疫菌的致病機制提供分子水平的證據(jù)。
[Abstract]:The plague is a kind of natural epidemic infectious disease caused by the plague yeriella ( hereinafter referred to as the plague bacteria ) . It has caused hundreds of millions of people to die and cause great disaster in the history of mankind . The plague is a kind of infectious disease caused by the epidemic prevention and control law of the People ' s Republic of China . The epidemic area of the plague in China has been continuously expanding since the 1990s , and the epidemic situation of human plague is increasing . Therefore , the prevention and cure of plague is of great significance to our country ' s economic development and social stability . Type 鈪，

本文編號：1449602