發(fā)布時間：2018-01-20 22:17

  本文關(guān)鍵詞： 西尼羅病毒 復制子 DNA疫苗 免疫原性　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：西尼羅病毒(West Nile virus)屬于黃病毒科黃病毒屬,該病毒感染人類可導致西尼羅熱、西尼羅腦炎、腦膜炎等嚴重疾病。自1999年首次在美國紐約暴發(fā)流行后,西尼羅病毒在北美地區(qū)迅速蔓延,每年可導致3000多人患病,上百人死亡。尤其是最近幾年,在全球變暖和國際交流日益頻繁的大環(huán)境下,西尼羅病毒感染已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重要威脅。目前尚無安全有效的人用西尼羅病毒疫苗。DNA疫苗是一種新型的疫苗形式。基于復制子技術(shù)的DNA疫苗有望成為西尼羅病毒疫苗研究的重要工具。 復制子(replicon)作為能自主復制的病毒亞基因組,是研究病毒復制機制及疫苗研發(fā)的理想工具。它具有病毒基因組的復制活性,但無法表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白,在細胞中不能產(chǎn)生有感染性的病毒顆粒,具有良好的安全性。復制子具有兩種傳遞形式:DNA形式和RNA形式。近幾年報道的西尼羅病毒復制子大都是RNA形式,這種基于SP6或T7啟動子的復制子具有操作繁瑣和不穩(wěn)定的缺點。而DNA形式的復制子基于CMV早期啟動子不需體外轉(zhuǎn)錄,可直接轉(zhuǎn)染真核細胞,具有良好的應(yīng)用前景。另外,黃病毒復制子的免疫原性目前尚不明確。 為此,本研究首先在西尼羅病毒全長感染性克隆基礎(chǔ)上,利用反向遺傳學技術(shù)構(gòu)建了一系列DNA形式的西尼羅病毒復制子,并通過表達報告基因?qū)椭谱踊钚赃M行了檢測。然后將構(gòu)建的DNA形式的西尼羅病毒復制子免疫小鼠,分別從體液免疫和細胞免疫方面對復制子的免疫原性進行了觀察。從而為西尼羅病毒DNA疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。 1.DNA形式的西尼羅病毒復制子的構(gòu)建與鑒定 為了構(gòu)建DNA形式的西尼羅病毒復制子,選用具有CMV啟動子的pWNIIrep-REN-IB質(zhì)粒載體作為復制子載體,首先將西尼羅病毒cDNA的3’半分子(NS1-3’UTR)連入該載體,再通過融合PCR等方法對連入的西尼羅病毒半分子的上游和下游序列分別進行了改造。為了保證復制子具有復制活性,保留了病毒基因組的非編碼區(qū),編碼C蛋白N端99個氨基酸和E蛋白C端26個氨基酸的結(jié)構(gòu)蛋白基因及全部非結(jié)構(gòu)基因。同時,在西尼羅病毒3’半分子的下游引入了丁型肝炎病毒的核酶(HDVr)及猴病毒40 (SV40)的多聚腺甘酸序列。最終獲得了西尼羅病毒復制子pWNrep,經(jīng)DNA酶切和測序證實無誤。在此基礎(chǔ)上,分別把eGFP和Rluc報告基因插入到復制子pWNrep結(jié)構(gòu)基因缺失區(qū),采用雙順反子策略獲得了兩個含有不同報告基因的西尼羅病毒復制子pWNrep/eGFP和pWNrep/Rluc。同時,構(gòu)建了pWNrep/Rluc相應(yīng)的復制缺陷對照pWNrep/Rluc△NS5。 為進一步在細胞中評價上述復制子的復制能力,分別將構(gòu)建的復制子轉(zhuǎn)染BHK21細胞,結(jié)果在pWNrep/eGFP轉(zhuǎn)染的細胞中可觀察到特異的GFP表達,并能夠持續(xù)至轉(zhuǎn)染后60 h;而轉(zhuǎn)染pWNrep/Rluc和pWNrep/Rluc△NS5復制子后,對細胞裂解物的熒光素酶活性進行檢測,結(jié)果顯示, pWNrep/Rluc轉(zhuǎn)染后24h,Rluc活性達到第一個峰值,從36h到60h,Rluc活性持續(xù)升高。而缺失了病毒復制酶(NS5)基因的pWNrep/Rluc△NS5對照組的Rluc活性迅速降低。進一步通過RT-PCR檢測表達Rluc細胞中的復制子RNA,結(jié)果表明,只有pWNrep/Rluc樣品中能檢測出西尼羅病毒3’UTR特異片段。這些結(jié)果說明,DNA形式的西尼羅病毒復制子能夠表達外源基因,具有良好的復制活性,為下一步觀察該復制子的免疫原性奠定了基礎(chǔ)。 2.DNA形式的西尼羅病毒復制子的免疫原性觀察 我們用復制子pWNrep質(zhì)粒通過肌肉注射途徑免疫4周齡的BAL B/c雌性小鼠,每2周免疫1次,共免疫3次�？蛰d體pVec和PBS(100μl/只)作為對照。首先采用間接免疫熒光法檢測小鼠血清中IgG抗體水平,結(jié)果表明,免疫三次后,pWNrep復制子DNA免疫組可檢測到特異識別西尼羅病毒NS1蛋白的IgG抗體,血清效價達1:160,而對照組均未檢測到相應(yīng)抗體的存在。同時,采用蝕斑減少中和試驗檢測了小鼠血清中針對西尼羅病毒的中和抗體水平。結(jié)果顯示,隨著免疫次數(shù)的增加,復制子免疫組的血清中和效價呈現(xiàn)一個動態(tài)增長的過程,初次免疫后第1周,血清效價為1:19,而初次免疫后第5周,效價達到1:47。初次免疫后第13周中和效價達1:55,而對照組均未檢測到中和抗體。結(jié)果表明:DNA形式的西尼羅病毒復制子能夠激活小鼠的體液免疫反應(yīng),誘導產(chǎn)生西尼羅病毒特異的中和抗體。我們進一步通過脾細胞增殖和脾細胞IFN-γ實驗分析了小鼠的細胞免疫水平。結(jié)果顯示,經(jīng)西尼羅病毒NS1抗原刺激后,復制子pWNrep DNA免疫組脾細胞增殖活性明顯增加,刺激指數(shù)(SI)達到(8.9±0.7)約為空載體對照組的3倍,為PBS對照組的4倍,具有顯著的統(tǒng)計學差異(p0.01)。其分泌的IFN-γ水平為(99.0±18.8)pg/ml也顯著高于對照組(p0.05)。由此表明,DNA形式的西尼羅病毒復制子能在小鼠體內(nèi)激活T細胞記憶性免疫應(yīng)答和細胞因子釋放通路,誘導高水平的T細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。 總之,本研究成功構(gòu)建了DNA形式的西尼羅病毒復制子,該復制子不僅具有良好的復制活性,而且在小鼠模型中能夠誘導有效的細胞和體液免疫反應(yīng)。該研究為西尼羅病毒DNA疫苗的研發(fā)提供了新的策略,也為其他蚊媒黃病毒復制子研究提供了新的方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【參考文獻】

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1 于學東;秦成峰;姜濤;陳水平;鄧永強;劉然;趙慧;李曉峰;朱武洋;于曼;秦鄂德;;含有海腎螢光素酶報告基因的登革4型病毒亞基因組復制子的構(gòu)建[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2008年02期

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本文編號：1449588