本文關(guān)鍵詞： Rhbdd3 NK細(xì)胞 TLR3 DAP12 急性肝損傷 Rhbdd3 NEMO TLR4 NF-κB A20　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分Rhbdd3分子抑制TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化及其機(jī)制研究 天然免疫應(yīng)答在機(jī)體抵抗病原體侵襲過程中發(fā)揮重要作用。NK細(xì)胞是一種重要的天然免疫細(xì)胞，通過釋放多種細(xì)胞因子及殺傷性物質(zhì)介導(dǎo)免疫活化和免疫監(jiān)視，在機(jī)體抵抗感染和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著近年來對(duì)天然免疫應(yīng)答中模式識(shí)別機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深入，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞也表達(dá)多種TLR，尤其是與T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞相比表達(dá)更高水平的TLR3。已證實(shí)，當(dāng)TLR3與其配體poly (I:C)相互作用后能以直接或間接的方式誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化。大量研究表明NK細(xì)胞功能紊亂參與了多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病的病理過程。TLR3觸發(fā)的NK細(xì)胞活化在肝臟炎癥與損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，NK細(xì)胞活化受到免疫系統(tǒng)的精密調(diào)控，然而目前關(guān)于NK細(xì)胞功能負(fù)向調(diào)控機(jī)制的研究卻并不深入。機(jī)體在生理情況下如何控制NK細(xì)胞不被過度活化以維持免疫穩(wěn)態(tài)、避免免疫病理?yè)p傷的發(fā)生？是否存在新型的調(diào)控蛋白參與控制TLR3或其他信號(hào)介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化？這些新型調(diào)控蛋白通過何種分子機(jī)制影響NK細(xì)胞活化，是否需要其他免疫細(xì)胞或免疫分子的參與？對(duì)這些科學(xué)問題的回答不但有助于深入了解NK細(xì)胞如何受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)以維持生理?xiàng)l件下的免疫穩(wěn)態(tài)，而且為NK細(xì)胞過度活化引發(fā)的相關(guān)疾病的控制提供潛在的藥物靶點(diǎn)。 Rhbdd3分子屬于一類含有Rhomboid結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，早期被稱為垂體瘤凋亡基因（pituitary tumor apoptosis gene，PTAG）。本人在碩士課題研究中發(fā)現(xiàn)Rhbdd3分子能夠通過控制DC成熟及抑制TLR觸發(fā)的NF-κB信號(hào)通路活化，抑制IL-6等炎癥因子的釋放，維持體內(nèi)Treg與Th1和Th17的平衡，進(jìn)而在整體水平上抑制自身免疫性疾病的發(fā)生。本課題中，我們研究了Rhbdd3分子是否在TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化過程中也具有調(diào)控作用，并進(jìn)一步研究了其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的TLR3觸發(fā)的急性肝損傷的抑制作用。 1. Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)節(jié)TLR3觸發(fā)的NK細(xì)胞活化 首先，我們從體內(nèi)外2個(gè)方面，研究Rhbdd3分子是否對(duì)NK細(xì)胞活化具有調(diào)控作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Rhbdd3~(-/-)小鼠來源的脾臟細(xì)胞在poly (I:C)刺激后比野生型對(duì)照組分泌更高水平的IFN-γ和IL-6，而在IL-12和IL-15刺激后分泌的IFN-γ和IL-6水平與對(duì)照組相似；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在poly (I:C)刺激后Rhbdd3~(-/-)小鼠脾臟細(xì)胞中NK1.1+細(xì)胞表達(dá)的胞內(nèi)granzyme B、perforin及IFN-γ水平比野生型對(duì)照組明顯增高，而IL-12和IL-15刺激后的表達(dá)水平與對(duì)照組相似，提示Rhbdd3分子能特異性調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，分別給予Rhbdd3~(-/-)和野生型小鼠體內(nèi)poly (I:C)處理后，發(fā)現(xiàn)Rhbdd3~(-/-)小鼠肝臟中的NK細(xì)胞募集比野生型小鼠明顯增多，且肝臟NK1.1~+NK細(xì)胞的胞內(nèi)granzyme B、perforin及IFN-γ表達(dá)水平及對(duì)NK細(xì)胞殺傷作用敏感的YAC-1腫瘤細(xì)胞的殺傷活性均比野生型明顯增強(qiáng)。綜合上述體內(nèi)外研究結(jié)果，表明Rhbdd3分子能夠負(fù)向調(diào)控TLR3觸發(fā)的脾臟及肝臟中NK細(xì)胞的活化，并抑制NK細(xì)胞在病理情況下在肝臟的募集。 2. Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控TLR3觸發(fā)的NK細(xì)胞活化的機(jī)制 （1）Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK細(xì)胞依賴于NK細(xì)胞與其他細(xì)胞的相互接觸 為了探討Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控TLR3觸發(fā)的NK細(xì)胞活化的機(jī)制，我們首先分離了DX5~+脾臟NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在DX5~+NK細(xì)胞單獨(dú)存在的情況下，無論Rhbdd3-/-小鼠還是野生型小鼠來源的DX5~+NK細(xì)胞在poly (I:C)刺激后都分泌相似低水平的IFN-γ，而無論有無poly (I:C)刺激，Rhbdd3~(-/-)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性均比野生型明顯增強(qiáng)。考慮到在沒有其他支持因素存在的情況下，單純NK細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下極易凋亡，我們?cè)谂囵B(yǎng)體系中加入IL-12和IL-15來支持NK細(xì)胞的生存。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IL-12和IL-15支持下，小鼠DX5~+NK細(xì)胞在poly (I:C)后分泌極高水平的IFN-γ；但是比較Rhbdd3-/-小鼠與野生型小鼠來源的DX5~+NK細(xì)胞，無論poly (I:C)刺激與否，都分泌同等高水平的IFN-γ。以上結(jié)果表明，在IL-12和IL-15存在的情況下，單獨(dú)存在的NK細(xì)胞在TLR3配體刺激后能夠發(fā)生明顯的活化，但Rhbdd3分子不能夠直接調(diào)控TLR3誘導(dǎo)的NK細(xì)胞活化，需要其他因素的存在。 由于脾臟包含多種細(xì)胞類型，于是我們推測(cè)是否其他細(xì)胞參與了Rhbdd3分子對(duì)TLR3觸發(fā)NK細(xì)胞活化的調(diào)控作用。首先，我們通過transwell共培養(yǎng)體系阻斷脾臟細(xì)胞中DX5~+NK細(xì)胞與余下的DX5~-細(xì)胞的相互接觸，發(fā)現(xiàn)在poly (I:C)誘導(dǎo)下脾臟細(xì)胞分泌的IFN-γ及NK1.1~+細(xì)胞上表達(dá)granzyme B的水平與未分隔的體系相比均明顯下降，表明在NK與其他細(xì)胞相互接觸的情況下，TLR3配體才能夠最佳地誘導(dǎo)NK活化。且在這種Transwell分隔體系下，TLR3配體刺激后，Rhbdd3~(-/-)和野生型小鼠脾細(xì)胞分泌的IFN-γ及NK1.1~+細(xì)胞上表達(dá)granzyme B的水平?jīng)]有明顯差異。因此，Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化依賴于NK細(xì)胞與其他細(xì)胞的相互接觸。 （2）Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK細(xì)胞依賴于NK細(xì)胞與DC或Kupffer細(xì)胞的相互接觸 已有文獻(xiàn)報(bào)道，NK細(xì)胞與DC能以細(xì)胞間相互接觸依賴的方式相互調(diào)節(jié)。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)Rhbdd3分子能夠負(fù)向調(diào)控TLR觸發(fā)的樹突狀細(xì)胞活化，于是我們推測(cè)DC等抗原提呈細(xì)胞可能是Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化過程中所依賴的細(xì)胞類型。此外，由于TLR3信號(hào)的過度活化是誘導(dǎo)肝臟炎癥與損傷的一種致病機(jī)制，因此我們選取了2種抗原提呈細(xì)胞，骨髓來源DC和肝臟Kupffer巨噬細(xì)胞（KC），研究是否這些細(xì)胞的存在參與了Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化。 我們將Rhbdd3~(-/-)小鼠或野生型小鼠來源的NK細(xì)胞分別與這兩種小鼠的骨髓來源DC或肝臟KC以不同組合共同培養(yǎng)，包括：WT NK~+WT DC（或KC）；WT NK~+Rhbdd3~(-/-)DC（或KC）；Rhbdd3~(-/-)NK~+WT DC（或KC）；Rhbdd3~(-/-)NK~+Rhbdd3~(-/-)DC（或KC），并同時(shí)給予poly (I:C)刺激。我們發(fā)現(xiàn)在與同一種基因型的DC或Kupffer細(xì)胞相互作用下，poly (I:C)能夠刺激Rhbdd3~(-/-)小鼠來源的NK細(xì)胞分泌比野生型NK細(xì)胞更高水平的IFN-γ，其中Rhbdd3~(-/-)NK1.1~+細(xì)胞胞內(nèi)IIFN-γ和granzyme B表達(dá)水平也顯著高于野生型NK細(xì)胞。此外，Rhbdd3~(-/-)DC比野生型DC更有效促進(jìn)poly(I:C)誘導(dǎo)的同一種NK細(xì)胞的活化，進(jìn)一步證實(shí)了以前的研究中Rhbdd3對(duì)TLR3觸發(fā)的DC成熟的負(fù)向調(diào)控作用。以上結(jié)果表明，DC及Kupffer細(xì)胞參與了Rhbdd3分子對(duì)TLR3觸發(fā)的NK細(xì)胞活化的負(fù)向調(diào)控作用。 （3）Rhbdd3分子通過抑制DAP12表達(dá)而抑制TLR3觸發(fā)的NK細(xì)胞活化 我們接下來深入研究了Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)節(jié)TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化的分子機(jī)制。首先我們檢測(cè)了Rhbdd3分子在TLR3刺激NK細(xì)胞前后的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)給予poly (I:C)處理或者體外用poly (I:C)刺激全脾細(xì)胞后，脾臟中NK細(xì)胞表達(dá)Rhbdd3分子的水平明顯增高，而在IL-12/15刺激下NK細(xì)胞表達(dá)Rhbdd3分子沒有變化，表明TLR3信號(hào)能夠上調(diào)NK細(xì)胞表達(dá)Rhbdd3分子。 除了TLR信號(hào)能夠活化NK細(xì)胞，NK細(xì)胞的活化還取決于其細(xì)胞表面的NK細(xì)胞活化型受體和抑制型受體介導(dǎo)信號(hào)的強(qiáng)弱，因此我們檢測(cè)了是否Rhbdd3分子參與調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表面這些受體的表達(dá)水平，然而結(jié)果顯示NK細(xì)胞表達(dá)這些受體不受Rhbdd3分子影響。 DAP12蛋白是與NK細(xì)胞活化受體相連的一種adaptor蛋白，對(duì)傳遞活化信號(hào)至關(guān)重要。雖然NK細(xì)胞表達(dá)活化受體不受Rhbdd3分子影響，但我們發(fā)現(xiàn)用干擾RNA阻斷野生型NK細(xì)胞中Rhbdd3分子的表達(dá)后，DAP12在蛋白水平明顯增強(qiáng)而在mRNA水平?jīng)]有明顯的差異，提示Rhbdd3分子可能在翻譯或翻譯后水平調(diào)控DAP12的表達(dá)。通過confocal顯微鏡，我們觀察到NK細(xì)胞中Rhbdd3分子在poly (I:C)刺激后與DAP12相互靠近而產(chǎn)生共定位。這些結(jié)果提示TLR3活化后，Rhbdd3分子能與DAP12相互作用并負(fù)向調(diào)控DAP12表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)負(fù)向調(diào)控NK細(xì)胞活化。 我們進(jìn)一步研究了在poly (I:C)刺激下，Rhbdd3~(-/-)來源NK細(xì)胞在與DC共培養(yǎng)后胞內(nèi)MAPK信號(hào)的活化情況，發(fā)現(xiàn)p-ERK、p-JNK及p-p38水平與野生型NK細(xì)胞相比明顯增高。同樣，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予poly (I:C)刺激后，Rhbdd3~(-/-)來源小鼠的脾臟NK細(xì)胞p-ERK、p-JNK及p-p38活化水平比對(duì)照組明顯增高，而NF-κB通路無明顯差異。 綜上表明，NK細(xì)胞在體內(nèi)受到TLR3信號(hào)刺激后上調(diào)Rhbdd3分子的表達(dá)，而Rhbdd3分子通過抑制DAP12的表達(dá)并控制下游MAPK的活化反饋性抑制TLR3介導(dǎo)的NK細(xì)胞活化。 3. Rhbdd3分子通過控制NK細(xì)胞活化而抑制TLR3誘導(dǎo)的急性肝損傷 鑒于NK細(xì)胞是TLR3誘導(dǎo)急性肝損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞，在上述研究基礎(chǔ)上，我們從整體角度進(jìn)一步研究了Rhbdd3分子是否在TLR3觸發(fā)的肝損傷中具有保護(hù)作用。我們發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)給予poly (I:C)刺激后，Rhbdd3~(-/-)小鼠血清中ALT、AST、IFN-γ及IL-6水平比野生型對(duì)照組明顯增高，肝臟病理顯示肝臟中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝組織壞死也比對(duì)照組明顯增強(qiáng)，提示Rhbdd3分子能有效保護(hù)TLR3觸發(fā)的急性肝損傷。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)，用抗NK1.1單克隆抗體清除體內(nèi)NK細(xì)胞可有效保護(hù)Rhbdd3~(-/-)及野生型小鼠在poly (I:C)注射后發(fā)生的急性肝損傷；在此基礎(chǔ)上，過繼回輸NK細(xì)胞后可恢復(fù)NK細(xì)胞清除的小鼠對(duì)poly (I:C)誘導(dǎo)急性肝損傷的敏感性，而回輸Rhbdd3~(-/-)NK細(xì)胞比回輸野生型NK細(xì)胞能導(dǎo)致NK細(xì)胞清除小鼠在poly (I:C)注射后發(fā)生更為嚴(yán)重的肝臟損傷。上述結(jié)果證實(shí)Rhbdd3分子通過控制NK細(xì)胞活化從而減弱TLR3觸發(fā)的急性肝損傷的發(fā)生。 綜上，通過本課題的研究我們得出如下結(jié)論：TLR3活化劑進(jìn)入機(jī)體后誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化并上調(diào)Rhbdd3分子的表達(dá)。在NK細(xì)胞與其他細(xì)胞相互作用的過程中，Rhbdd3分子通過下調(diào)NK細(xì)胞中DAP12表達(dá)而抑制NK細(xì)胞在與其他細(xì)胞相互作用中獲得的活化信號(hào)，并抑制其下游MAPK通路活化；另一方面，Rhbdd3分子還能抑制NK細(xì)胞向肝臟的募集及NK細(xì)胞與肝臟Kupffer細(xì)胞的相互作用，最終達(dá)到控制TLR3觸發(fā)的急性肝臟損傷的作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)了Rhbdd3對(duì)NK細(xì)胞活化的負(fù)向調(diào)控功能并闡明了其分子機(jī)制，揭示了機(jī)體在天然免疫應(yīng)答過程中如何實(shí)現(xiàn)免疫自穩(wěn)的新型調(diào)控機(jī)制，為NK細(xì)胞相關(guān)的急性炎癥損傷的控制提供了可能的靶點(diǎn)。 第二部分Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控TLR誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞活化的機(jī)制研究 樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）是機(jī)體功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，通過模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原體表達(dá)的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），在炎癥反應(yīng)、天然免疫應(yīng)答以及后續(xù)激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。樹突狀細(xì)胞活化的調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于感染、腫瘤及自身免疫性疾病等疾病的治療策略研究以及疫苗的設(shè)計(jì)研發(fā)都具有重要意義。作為研究最為廣泛的一類PRRs，TLRs表達(dá)于DC等天然免疫細(xì)胞，其介導(dǎo)的信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)DC成熟和活化。其中TLR4可以通過Myd88依賴和非依賴方式最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；在Myd88依賴途徑中，TLR4通過招募Myd88而活化IRAK1和IRAK4激酶，進(jìn)而招募并結(jié)合TRAF6，促進(jìn)TRAF6和NEMO發(fā)生K63多聚泛素化。K63多聚泛素鏈的形成激活下游TAK1復(fù)合體，并激活I(lǐng)KK復(fù)合體進(jìn)而促進(jìn)IκB磷酸化并與NF-κB解離，釋放NF-κB入核，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生。對(duì)于TLR如何激活下游信號(hào)通路促進(jìn)NF-κB活化已有較清楚認(rèn)識(shí)，然而對(duì)于TLR介導(dǎo)的NF-κB活化過程是如何受到調(diào)控的研究并不深入。 蛋白質(zhì)分子的泛素化是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)重要分子機(jī)制。在誘導(dǎo)NF-κB活化的信號(hào)通路中，NEMO分子通過泛素連接（NEMO-ubiquitin binding，NUB）結(jié)構(gòu)域連接K63多聚泛素鏈，與TAB2/3共同促進(jìn)NF-κB活化。雖然NEMO泛素化在TLR信號(hào)活化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用得到深入研究，然而其具體分子機(jī)制，特別是NEMO泛素化如何受到調(diào)節(jié)以及NEMO泛素位點(diǎn)與泛素鏈的相互關(guān)系尚不十分清楚。對(duì)于機(jī)體如何調(diào)控TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化，特別是NEMO泛素化對(duì)NF-κB活化的調(diào)節(jié)作用的具體分子機(jī)制的研究將有助于深入認(rèn)識(shí)天然免疫應(yīng)答的活化與調(diào)控機(jī)制，為免疫相關(guān)疾病的預(yù)防與控制提供了新的研究思路。 本人在碩士課題研究中發(fā)現(xiàn)Rhbdd3分子通過其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO相互作用抑制TLR4誘導(dǎo)的NF-κB活化，抑制TLR觸發(fā)的DC成熟和炎性因子的產(chǎn)生，進(jìn)而控制Th17及Treg分化的平衡及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題中我們深入研究了Rhbdd3分子如何影響TLR4誘導(dǎo)NF-κB活化的分子機(jī)制。 1. Rhbdd3分子通過UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO蛋白K302位點(diǎn)連接的K27位多聚泛素鏈相互作用，進(jìn)而抑制NF-κB活化 本人在碩士期間的研究表明，Rhbdd3~(-/-)小鼠來源BMDC在LPS刺激后與野生型BMDC相比NF-κB活化明顯增強(qiáng)，而過表達(dá)Rhbdd3能顯著抑制TNF-α或LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化。通過轉(zhuǎn)染突變的Rhbdd3分子和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)Rhbdd3分子通過其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO分子發(fā)生相互作用。 在本課題中，我們進(jìn)一步對(duì)NEMO中與Rhbdd3分子相互作用的關(guān)鍵性位點(diǎn)進(jìn)行了尋找。我們對(duì)NEMO中可能發(fā)生泛素化的保守位點(diǎn)進(jìn)行了突變，構(gòu)建了一系列攜帶不同突變位點(diǎn)的NEMO表達(dá)質(zhì)粒。通過將突變的Rhbdd3分子和NEMO分子共轉(zhuǎn)染細(xì)胞及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，K302位點(diǎn)是NEMO蛋白上與Rhbdd3分子相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。 雖然很多證據(jù)表明泛素分子中K48的多聚泛素化鏈的形成主要介導(dǎo)發(fā)生泛素化信號(hào)分子的降解作用，而K63位的多聚泛素鏈主要介導(dǎo)信號(hào)分子的定位和活化作用，泛素中其他位點(diǎn)發(fā)生的多聚泛素鏈對(duì)信號(hào)分子的作用目前罕有報(bào)道。我們對(duì)泛素分子中的不同賴氨酸位點(diǎn)分別進(jìn)行了點(diǎn)突變，構(gòu)建了一系列攜帶突變泛素分子基因的表達(dá)質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒中只保留了1個(gè)正常Lys位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變泛素中K27位點(diǎn)的質(zhì)粒可完全消除Rhbdd3分子與NEMO蛋白的相互作用。 可見，Rhbdd3分子依賴其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO蛋白K302位點(diǎn)連接的K27多聚泛素鏈相互作用，進(jìn)而抑制TLR4誘導(dǎo)的NF-κB活化。 2. Rhbdd3分子促進(jìn)A20介導(dǎo)的NEMO K278/K392位點(diǎn)發(fā)生K63位去泛素化，進(jìn)而抑制TLR誘導(dǎo)的NF-κB活化 （1）Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K278和K392位點(diǎn)發(fā)生K63多聚泛素化 接下來，我們進(jìn)一步研究了Rhbdd3分子與NEMO相互作用后如何調(diào)控NF-κB活化。NEMO蛋白的K63位多聚泛素化是TLR誘導(dǎo)IKK復(fù)合體活化的關(guān)鍵步驟。我們發(fā)現(xiàn)，Rhbdd3~(-/-)BMDC的K63泛素化水平明顯高于對(duì)照組DC，且過表達(dá)Rhbdd3分子能抑制NEMO的K63多聚泛素化，表明Rhbdd3分子參與控制NEMO的K63多聚泛素化；此外，NEMO分子上K278和K392位點(diǎn)突變可顯著抑制NEMO蛋白結(jié)合K63泛素鏈，表明NEMO的K63多聚泛素鏈主要結(jié)合在NEMO的K278和K392位點(diǎn)。因此，Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K278位和K392位發(fā)生K63的多聚泛素化。 （2）Rhbdd3分子招募并與A20結(jié)合從而促進(jìn)A20與NEMO的相互作用 上述研究表明Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K63多聚泛素化。已有文獻(xiàn)報(bào)道A20通過去泛素化NEMO上連接的K63位多聚泛素鏈抑制TLR誘導(dǎo)的NF-κB活化。于是我們進(jìn)一步研究是否A20在Rhbdd3分子負(fù)向調(diào)控NEMO的K63泛素化中發(fā)揮作用。我們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rhbdd3-/-DC在LPS誘導(dǎo)后Rhbdd3分子和A20的結(jié)合比對(duì)照組顯著減弱；過表達(dá)全長(zhǎng)Rhbdd3能同時(shí)結(jié)合NEMO和A20，，并促進(jìn)A20與NEMO的相互結(jié)合；缺失189-321序列的Rhbdd3突變體則不具有此效應(yīng)。綜上表明，Rhbdd3分子通過其189-321位未知保守序列招募并與A20相互作用，促進(jìn)A20與NEMO的結(jié)合，從而促進(jìn)A20對(duì)NEMO的K63位多聚泛素鏈的降解作用，實(shí)現(xiàn)控制NF-κB活化。 綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了Rhbdd3分子控制TLR誘導(dǎo)NF-κB活化的分子機(jī)制，即Rhbdd3通過其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO K302位點(diǎn)的K27多聚泛素鏈相互作用，并通過其189-321位未知保守序列招募A20并與A20分子相互作用，促進(jìn)A20介導(dǎo)的NEMO蛋白K278/K392位點(diǎn)連接的K63位泛素鏈去泛素化，進(jìn)而抑制NF-κB活化。本課題首次揭示了Rhbdd3負(fù)向調(diào)控TLR/NEMO/NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制，豐富了對(duì)蛋白泛素化調(diào)控的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。我們對(duì)Rhbdd3的免疫學(xué)功能與作用機(jī)制的研究不但有助于解釋與NF-κB過度活化相關(guān)的炎癥性疾病的發(fā)生機(jī)制，也有可能成為一個(gè)藥物靶點(diǎn)用于炎癥性、自身免疫性疾病或者免疫缺陷病等疾病的治療。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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1 王澤坤;cIAP2蛋白抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 范金秀;PRRSV Nsp11去泛素化活性及其抑制NF-κB的分子機(jī)制研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

本文編號(hào)：1449424