發(fā)布時間：2018-01-20 03:38

  本文關(guān)鍵詞： 炎癥性肺病 p38MAPK抑制劑 糖皮質(zhì)激素 小鼠肺泡巨噬細胞 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化子-3 腫瘤壞死因子-α 白介素-10 脂多糖　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：長期以來糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids, GCs）作為重要抗炎藥物用于炎癥性肺�。╥nflammatory lung disease, ILD）的治療。ILD是由于炎癥、免疫等各種因素導(dǎo)致肺及支氣管內(nèi)大量巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，釋放大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生瀑布級聯(lián)，進而引起肺內(nèi)炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡造成的肺臟疾病。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），可以通過刺激機體各種免疫細胞產(chǎn)生大量的細胞炎性介質(zhì)，進而誘發(fā)ILD。肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AMs)是LPS的主要效應(yīng)細胞，釋放內(nèi)源性炎癥因子產(chǎn)生瀑布級聯(lián)是導(dǎo)致炎癥發(fā)生、發(fā)展的根本原因。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子-3（Signal transducers and activators of transcription-3,STAT3）的激活在調(diào)控ILD起著關(guān)鍵的作用。抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能減少致炎癥細胞因子的釋放。本實驗以小鼠AM為研究對象，觀察激素與p38MAPK特異性抑制劑SB203580對LPS刺激的上述細胞分泌TNF-α、IL-10的影響，分析兩者是否存在協(xié)同作用并進一步探討STAT信號途徑在其中的作用，為臨床應(yīng)用激素及p38MAPK抑制劑治療ILD提供理論基礎(chǔ)。 方法： 1.ELISA檢測LPS刺激細胞上清液中的TNF-α濃度。培養(yǎng)MH-S細胞株，調(diào)節(jié)細胞濃度到1×10~6/ml，于24孔板中培養(yǎng)過夜，隨機分組：①對照組：加入與各實驗組體積相同的無血清RPMI1640培養(yǎng)液；②LPS+Dex組：終濃度為1×10~(-6)mol/L的DEX預(yù)孵育2h后LPS刺激2h、6h、12h；③Dex組：終濃度為1×10~(-6)mol/L的DEX刺激2h、6h、12h；④Dex+SB203580+LPS組：終濃度為1×10~(-6)mol/L的DEX預(yù)孵育2h后，終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；⑤LPS+SB203580組：終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20min后LPS刺激2h、6h、12h；⑥LPS組：終濃度為100ng/ml的LPS刺激2h、6h、12h。 各組細胞刺激成功后取上清液， ELISA測定細胞上清液中TNF-α的含量。 2. ELISA檢測LPS刺激細胞上清液中的IL-10濃度。方法及分組同TNF-α測定。 3.免疫細胞化學(xué)法檢測MH-S細胞中p-STAT3的表達。將MH-S細胞于24孔板中進行爬片，調(diào)節(jié)細胞濃度到1×106/ml，培養(yǎng)過夜，隨機分組：①對照組：加入與各實驗組體積相同的無血清RPMI1640培養(yǎng)液；②LPS+Dex組：終濃度為1×10~(-6)mol/L的DEX預(yù)孵育2h后，LPS刺激30min；③Dex組：終濃度為1×10~(-6)mol/L的DEX刺激30min；④Dex+SB203580+LPS組：終濃度為1×10~(-6)mol/L的DEX預(yù)孵育2h后，終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20min后，LPS刺激30min；⑤LPS+SB203580組：終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20min后，LPS刺激30min；⑥LPS組：終濃度為100ng/ml的LPS刺激30min。各組MH-S細胞刺激成功后，用免疫細胞化學(xué)法檢測各組細胞中的p-STAT3表達變化。 4.Western blot方法檢測MH-S細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3的表達。實驗分組同免疫細胞化學(xué)法，于6孔板中上述各組細胞刺激成功后收集細胞，檢測細胞內(nèi)p-STAT3、STAT3表達。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，各組之間進一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗進行兩兩比較分析是否有顯著性差異，P0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.細胞上清液中TNF-α含量的變化：LPS刺激MH-S細胞后，細胞上清液中TNF-α含量在2h已經(jīng)開始升高，6h達高峰，12h稍下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；DEX預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；SB203580預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；DEX和SB203580共同預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，進一步抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加，與DEX+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)，與SB+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.細胞上清液中IL-10含量的變化：LPS刺激MH-S細胞后，細胞上清液中IL-10含量在2h已經(jīng)開始升高，6h達高峰，12h已經(jīng)開始下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；DEX預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；SB203580預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；DEX和SB203580共同預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，進一步抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加，與DEX+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)，與SB+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.免疫細胞化學(xué)結(jié)果表明：對照組細胞僅見微弱黃染；LPS刺激30min后細胞黃染最強；用DEX預(yù)處理后，LPS刺激引起的細胞黃染減弱；用SB203580預(yù)處理后，LPS刺激引起的細胞黃染減弱；用DEX和SB203580預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，LPS刺激引起的細胞黃染進一步減弱；用DEX預(yù)處理后，未給予LPS刺激細胞微弱黃染。各組與對照組比較p-STAT3表達均顯著增高(P0.05)；與LPS組比較，DEX+LPS組、SB+LPS組、DEX+SB+LPS組p-STAT3表達均顯著減少(P0.05)；與DEX+LPS組、SB+LPS組比較，DEX+SB+LPS組p-STAT3表達進一步減少(P0.05)。 4. Western-blot檢測p-STAT3結(jié)果表明：對照組細胞內(nèi)p-STAT3微量表達；LPS刺激30min后細胞內(nèi)p-STAT3表達最強；用DEX預(yù)處理后，LPS刺激引起的細胞內(nèi)p-STAT3表達減弱；用SB203580預(yù)處理后，LPS刺激引起的細胞內(nèi)p-STAT3表達減弱；用DEX和SB203580預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，LPS刺激引起的細胞內(nèi)p-STAT3表達進一步減弱；用DEX預(yù)處理后，未給予LPS刺激細胞內(nèi)p-STAT3表達微弱。各組與對照組比較p-STAT3表達均顯著增高(P0.05)；與LPS組比較，DEX+LPS組、SB+LPS組、DEX+SB+LPS組p-STAT3表達均顯著減少(P0.05)；與DEX+LPS組、SB+LPS組比較，，DEX+SB+LPS組p-STAT3表達進一步減少(P0.05)。 5. Western-blot檢測STAT3結(jié)果表明：各實驗組細胞內(nèi)非磷酸化STAT3表達，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1. LPS可引起MH-S細胞上清液中的TNF-α和IL-10分泌增加，用DEX、SB203580分別干預(yù)后，可抑制TNF-α、IL-10分泌，DEX和SB203580協(xié)同抑制TNF-α、IL-10分泌。結(jié)果提示p38MAPK抑制劑SB203580可能改善ILD激素抵抗，同激素有協(xié)同作用。 2. LPS可引起MH-S細胞磷酸化STAT3表達增加，DEX、SB203580可使磷酸化STAT3表達減少，二者有協(xié)同作用。這提示DEX、SB203580可能通過p-STAT3的介導(dǎo)，進而抑制TNF-α、IL-10分泌。 3．上述結(jié)果從細胞因子和信號通路方面提示p38MAPK抑制劑SB203580可能改善ILD激素抵抗，同激素有協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳葆菁;朱軍;檀衛(wèi)平;麥賢弟;黃花榮;李靜;李文益;;地塞米松對急性過敏性哮喘小鼠肺AQP5表達的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年09期

2 李鋒;周新;;p38絲裂原活化蛋白激酶與慢性氣道疾病[J];中華哮喘雜志(電子版);2010年04期

本文編號：1446687