本文關鍵詞： 脂肪干細胞 細胞治療 輔助移植 Edu 干細胞標記 細胞示蹤　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景： 人脂肪干細胞(ADSC,Adipose-derived stem cells)是從脂肪組織中分離出來的,并能顯示出持續(xù)的細胞增殖能力及向不組織細胞定向分化的能力的細胞,具有組織量多,來源廣泛的優(yōu)點。近年來,被廣泛地應用于基礎研究及臨床細胞治療中,且具有巨大的發(fā)展?jié)摿�。自體脂肪移植在整形外科中廣泛應用,但成活率低,需重復治療等缺點是整形外科醫(yī)生面臨的重大問題。為了解決這一問題,需要對脂肪成活機制準確把握。在脂肪成活過程中,ADSC的作用尤為明顯。一些理論推斷脂肪干細胞的作用通過脂肪干細胞的增殖、分化成新的脂肪組織并提供適應的環(huán)境來促進脂肪的成活,但未有定論,且需要更多、更準確的實驗來回答這一問題。我們的實驗選用有種新的示蹤劑,通過細胞示蹤來探究脂肪干細胞在脂肪移植中的作用機制。Edu是一種核酸類似物,在細胞分裂增殖的過程中參與到核染色體中達到標記目的。 目的： 觀察體外培養(yǎng)時不同培養(yǎng)階段的人脂肪干細胞的細胞形態(tài)和生物學特點。通過實驗初步確立最佳的標記濃度及標記時間組合。進一步交通過與未標記的干細胞的進行增殖及分化影響的比較以選出最適標記濃度及時間。 方法： 1、人ADSC的體外培養(yǎng)分離、培養(yǎng)和鑒定。經(jīng)知隋同意后,取吸脂手術來源的脂肪顆粒,使用酶消化法獲得SVF細胞,原代培養(yǎng)在7-10天時達80%-90%的細胞融合,干細胞進一步傳代培養(yǎng)進行純化和擴增。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。細胞傳至第3代后,分別用于鑒定細胞及用于細胞標記的研究。 2、Edu在不同濃度及時間標記的組合下進行研究。分別采5uM,10uM,20uM,50uM的濃度及12小時,24小時進行標記,Edu標記后的細胞去除含Edu的培養(yǎng)基,制成單細胞懸液并固定細胞,以Alexa-555染色后行流式細胞分析儀檢測標記率,從而挑選出各時間點中較適宜的標記組合。 3、測定Edu在較適宜的標記率情況下對細胞生長及分化的影響,以未標記細胞作為空白對照。Edu對干細胞細胞活性及增殖的影響以臺盼藍排斥反應及MTT實驗證實。 4、測定Edu標記后影響細胞分化的能力。即去除Edu后,脂肪干細胞行定向成脂及成骨誘導,誘導結束后行油紅O染色及茜素紅染色鑒定分化結果。數(shù)據(jù)以SPSS13.0進行分析。 結果： 原代細胞貼壁后呈一定方向的成纖維細胞樣生長。在第5到第7天時細胞克隆逐漸變大并相互融合并形成單層。7-10天時將細胞消化下來并進行傳代。傳代后細胞生長迅速,2-3天即可長滿培養(yǎng)皿的底部并進一步傳代。3代細胞行流式細胞儀分析細胞表型時表達細胞表面標志如CD90,CD105,CD44,而且不表達或弱表達細胞表面標志CD34,CD45。 Edu的標記是在細胞分裂增殖時,新合成的細胞才能被標記上。流式結果表明,分別在10uM,12h和5uM,24h標記時,細胞標記率可達約90%。更高的濃度并不能明顯提高細胞的標記率,且會對細胞活性有影響。因此,選定此兩組作為實驗組,未標記細胞作為對照組,分析標記后對細胞增殖分化的影響。 標記后的細胞即可被消化,制成單細胞懸液。臺盼藍排斥實驗數(shù)據(jù)顯示細胞死亡比例各組間無統(tǒng)計學差異。MTT實驗分析,三組間10uM,12h與對照組曲線較相近,但略低,5uM,24h與對照組曲線較遠,證實標記物對細施增殖有一定的影響,以10uM,12h組標記者影響較小。 標記后的細胞去除Edu后定向分化,成脂誘導2周,成骨誘導3周。分別以油紅O染色及茜素紅染色,隨機每高倍鏡視野下計數(shù)成脂細胞數(shù)及鈣結節(jié)數(shù),數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)二者無統(tǒng)計學意義。 本實驗在體外培養(yǎng)脂肪干細胞時,確認P3代以后的細胞較為純化化并可以用來實驗分析。應用Edu標記脂肪干細胞并首次應用流式方法測定其精確的標記率,通過對其生長及定向分化能力的測定,得出最適濃度組合10uM,12h,對進一步研究脂肪干細胞在輔助脂肪移植中的作用具有指導意義。
[Abstract]:Research background:
Human adipose derived stem cells (ADSC, Adipose-derived stem cells) was extracted from adipose tissue, and can demonstrate the ability of cell proliferation and sustained to tissue differentiation of cells with tissue volume, wide source of advantages. In recent years, is widely used in basic research and clinical cell therapy, and has great potential for development. Autologous fat transplantation is widely used in plastic surgery, but the survival rate is low, the need to repeat the treatment of defects is a major problem facing the plastic surgeon. In order to solve this problem, need to accurately grasp the survival mechanism of fat in fat. The survival process, the ADSC effect is particularly obvious. Some theories postulate that adipose derived stem cells by adipose derived stem cel proliferation, differentiation of adipose tissue and provide a new adaptation of the environment to promote the survival of fat, but not conclusive, and more Much more accurate experiments to answer this question. Our experiment with a new tracer, tracer through the cell to explore the mechanism of.Edu adipose derived stem cells in fat transplantation is a kind of nucleic acid analogues, in the process of cell proliferation involved in nuclear chromosome markers to reach.
Objective:
In vitro culture of different cell morphology and biological characteristics of stem cell stage of human adipose. By preliminary experiments to determine the optimal marker concentration and marking time combination. Further traffic with unlabeled stem cells to influence the proliferation and differentiation to choose the most suitable markers of concentration and time.
Method錛，

本文編號：1445806