本文關(guān)鍵詞： 臍帶 間充質(zhì)干細胞 角蛋白 雪旺細胞 誘導(dǎo)分化　出處：《暨南大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）的基本生物學(xué)特性。摸索人發(fā)角蛋白（HHK）萃取的最佳條件，同時觀察其與hUC-MSCs的生物相容性。采用不同的方法誘導(dǎo)hUC-MSCs向雪旺細胞(SCs)分化，探討HHK在其中的作用，并尋找最優(yōu)的誘導(dǎo)分化方案，為hUC-MSCs用于周圍神經(jīng)和脊髓損傷修復(fù)提供理論依據(jù)。 方法：用酶消法分離hUC-MSCs，通過普通光學(xué)顯微鏡觀察其生長狀態(tài)，原子力顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征，采用MTT法觀察P3代生長曲線及P1-P8的細胞增殖活力，流式細胞術(shù)測定P1-P6的細胞生長周期和鑒定細胞表型。還原法提取HHK，觀察其對hUC-MSCs的增殖及趨化作用。用不同濃度的HHK溶液包被培養(yǎng)瓶，觀察其對hUC-MSCs貼壁和粘附的影響。隨機將hUC-MSCs分為A、B、C、D、E、F共6組，分別采用復(fù)合誘導(dǎo)因子+HHK、復(fù)合誘導(dǎo)因子、共培養(yǎng)+HHK、共培養(yǎng)、HHK、普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，9天后采用HE染色和原子力顯微鏡觀察其觀察其形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化。免疫細胞熒光觀察分化后細胞S-100和GFAP特異性蛋白表達，，流式細胞儀定量檢測分化后S-100蛋白表達陽性率及細胞凋亡率。 結(jié)果：采用酶消法成功分離得到了純度較高的hUC-MSCs，P1-P6代細胞周期及P1-P8代細胞的生長活力無明顯差異。流式細胞術(shù)鑒定細胞表達CD105、CD90、CD73、CD54、CD44、CD13、CD29，不表達CD34、CD14、CD45、HLA-DR。采用還原法成功萃取了HHK，適當(dāng)濃度的HHK有提高細胞增殖活力、促進細胞遷移、加速細胞貼壁和增加粘附力的作用。經(jīng)SCs定向誘導(dǎo)分化后，細胞逐漸變成長梭形，兩極有細長突起，原子力觀察細胞核表面突起增多。細胞免疫熒光法觀測到誘導(dǎo)后hUC-MSCs表達S-100蛋白和GFAP蛋白明顯增高，流式細胞儀定量檢測到hUC-MSCs表達S-100蛋白增高、細胞凋亡率降低。6組中前四組發(fā)生不同程度的誘導(dǎo)分化，后兩組未見細胞分化，其中分化效率以細胞因子組高于共培養(yǎng)組，加HHK組高于未加HHK組；細胞凋亡率以共培養(yǎng)組低于細胞因子組，加HHK組低于未加HHK組。分化效率與細胞凋亡率成正相關(guān)，但HHK可以降低細胞凋亡率提高誘導(dǎo)分化率。 結(jié)論：本實驗成功在體外分離、培養(yǎng)及鑒定了hUC-MSCs。采用還原法萃取的HHK具有較好的生物相容性，可提高hUC-MSCs增殖活力、促進細胞遷移和粘附。HHK聯(lián)合復(fù)合因子為最佳誘導(dǎo)方案，可以顯著提高hUC-MSCs向SCs分化效率并降低細胞凋亡率。
[Abstract]:Objective: to study the basic biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) and to explore the optimum conditions for extraction of human hair keratin (HHK). At the same time, the biocompatibility of hUC-MSCs with hUC-MSCs was observed. Different methods were used to induce the differentiation of hUC-MSCs into Schwann cells, and to explore the role of HHK in the differentiation. The optimal differentiation induction scheme was found to provide theoretical basis for the application of hUC-MSCs in the repair of peripheral nerve and spinal cord injury. Methods: the growth state of hUC-MSCs was observed by ordinary optical microscope and morphological characteristics were observed by atomic force microscope (AFM). The growth curve of P3 generation and the proliferative activity of P1-P8 were observed by MTT. The cell cycle and phenotype of P1-P6 were determined by flow cytometry. HHK was extracted by reduction method. The proliferation and chemotaxis of hUC-MSCs were observed. The culture bottle was coated with different concentrations of HHK solution. To observe the effect of hUC-MSCs on adhesion and adhesion of hUC-MSCs, hUC-MSCs was randomly divided into 6 groups, which were treated with HHK. Compound induction factor, co-culture HHK, co-culture HHK, common culture medium. After 9 days, the morphological and ultrastructural changes were observed by HE staining and atomic force microscopy, and the expression of S-100 and GFAP specific proteins were observed by immunofluorescence. The positive rate of S-100 protein expression and apoptosis rate after differentiation were quantitatively detected by flow cytometry. Results: high purity hUC-MSCs was obtained by enzyme digestion. There was no significant difference in cell cycle of P1-P6 passage and growth activity of P1-P8 passage cells. Flow cytometry was used to identify the expression of CD105, CD90, CD73, CD54 and CD44. CD13, CD29, CD34, CD14, CD45, HLA-DR.HHK was successfully extracted by reductive method, and the appropriate concentration of HHK could improve the proliferation of HHKcells. Promote cell migration, accelerate cell adhesion and increase adhesion. After SCs induced differentiation, the cells gradually became fusiform, with slender processes at the two poles. The expression of S-100 protein and GFAP protein in hUC-MSCs was significantly increased after induction by atomic force. Flow cytometry showed that the expression of S-100 protein in hUC-MSCs was increased, and the apoptosis rate was decreased in the first four groups, but no differentiation was found in the latter two groups. The differentiation efficiency of cytokine group was higher than that of co-culture group, and that of HHK group was higher than that of no HHK group. The rate of apoptosis in co-culture group was lower than that in co-culture group, and that in HHK group was lower than that in untreated HHK group. The differentiation efficiency was positively correlated with the apoptosis rate, but HHK could decrease the apoptosis rate and increase the induced differentiation rate. Conclusion: HHK extracted by reductive method has good biocompatibility and can improve the proliferative activity of hUC-MSCs. Promoting cell migration and adhesion of HHK combined with compound factor could significantly increase the differentiation efficiency of hUC-MSCs into SCs and decrease the rate of apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1445777