本文關(guān)鍵詞：乳酸對羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化的影響　出處：《華東理工大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)具有獲取方便、對供體無傷害、免疫耐受、無倫理道德問題等特點,使其成為繼骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)之后另一備受關(guān)注的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),在組織工程、細(xì)胞治療和基因治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而眾所周知,由于組織中hAMSCs含量極少,且在體外長期擴(kuò)增過程中易于喪失自我更新能力和多向分化潛能,因此其在臨床上的應(yīng)用受到嚴(yán)重限制。在hAMSCs培養(yǎng)過程中,眾多因素影響細(xì)胞擴(kuò)增和分化,其中營養(yǎng)物耗竭和代謝副產(chǎn)物累積所導(dǎo)致的培養(yǎng)環(huán)境惡化是限制／抑制細(xì)胞擴(kuò)增和分化的主要問題之一。乳酸是細(xì)胞消耗葡萄糖等營養(yǎng)物時的代謝副產(chǎn)物,在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中對細(xì)胞生長、代謝和產(chǎn)物生成具有顯著影響,同時它也是組織工程中聚乳酸(PLA)等可降解生物材料的降解產(chǎn)物,無疑會對細(xì)胞擴(kuò)增和分化產(chǎn)生重要影響,但在干細(xì)胞和組織工程領(lǐng)域人們對乳酸的作用,特別是它對hAMSCs擴(kuò)增和分化的影響及其調(diào)控作用,卻知之甚少。此外,目前常規(guī)的培養(yǎng)方式一般在方瓶或平皿中進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng),不僅細(xì)胞生長面積有限,而且還因缺少流體混合,造成培養(yǎng)環(huán)境不均一,加之需要頻繁的消化傳代等操作,難以實現(xiàn)細(xì)胞規(guī)模化擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化,而且收獲細(xì)胞的均一性也往往無法保證,因此平面單層培養(yǎng)很難滿足實驗研究和臨床應(yīng)用對細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量及定向誘導(dǎo)分化的要求。為此,深入認(rèn)識hAMSCs生長、代謝和分化的特性,了解培養(yǎng)環(huán)境對細(xì)胞生理狀態(tài)和維持干細(xì)胞特性的影響,是解決上述問題的前提,也是本文研究工作的核心所在。 首先,本文分別在常氧和低氧環(huán)境下考察hAMSCs的擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化能力以及在擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)過程中代謝副產(chǎn)物乳酸的生成,并將之與BMMSCs進(jìn)行對照。實驗發(fā)現(xiàn),氧環(huán)境對hAMSCs的影響與BMMSCs一樣,低氧環(huán)境更有利于細(xì)胞擴(kuò)增；然而低氧環(huán)境卻不利于hAMSCs的成骨誘導(dǎo)分化,導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡脫落。另外,hAMSCs在低氧環(huán)境下擴(kuò)增時較常氧下產(chǎn)生了更多的乳酸,在培養(yǎng)后期乳酸濃度達(dá)到約15mmol/L,且其乳酸比生成速率及乳酸對葡萄糖的得率分別為常氧組的1.89和1.45倍；在常氧環(huán)境下誘導(dǎo)hAMSCs成骨分化也會產(chǎn)生大量的乳酸,特別在誘導(dǎo)后期乳酸濃度超過15 mmol/L。 鑒于hAMSCs在體外擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化過程中均有大量乳酸生成和積累,為此本文進(jìn)一步考察了乳酸對hAMSC體外擴(kuò)增、代謝、集落形成能力以及成骨誘導(dǎo)分化等產(chǎn)生的影響及其機(jī)制。同樣地,在實驗過程中BMMSCs作為參照。結(jié)果表明,乳酸濃度在10 mmol/L以上時,對hAMSCs體外擴(kuò)增、集落形成能力、葡萄糖消耗和乳酸生成等均有抑制作用,并且發(fā)現(xiàn)乳酸的這種抑制作用主要來自于乳酸分子本身及其引起的培養(yǎng)基pH下降,而其引起的高滲透壓則影響較小。另外,在成骨誘導(dǎo)實驗過程中發(fā)現(xiàn),乳酸(成骨誘導(dǎo)后期濃度在20 mmol/L以上時)能夠抑制hAMSCs的成骨分化,這主要是由于乳酸分子本身及低pH環(huán)境能夠通過阻遏轉(zhuǎn)錄因子Osterix基因的表達(dá)降低堿性磷酸酶活性和骨橋蛋白基因的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致hAMSCs胞外鈣結(jié)節(jié)的減少。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn),高濃度乳酸對hAMSCs成骨分化的抑制作用可能與此濃度下乳酸促進(jìn)hAMSCs向成脂肪細(xì)胞分化有關(guān)。在BMMSCs的成骨誘導(dǎo)過程中高濃度乳酸對其成骨分化也有抑制作用,但與hAMSCs不同的是,乳酸對BMMSCs成骨分化的抑制作用不僅與乳酸分子本身有關(guān),而且與乳酸引起的低pH和高滲透壓(334mOsm/kg)環(huán)境也有關(guān)。另外,雖然在成骨誘導(dǎo)分化過程中乳酸對hAMSCs和BMMSCs的成骨分化具有抑制作用,但卻在一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞增殖。 最后,本文在認(rèn)識了乳酸對hAMSCs擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化影響的基礎(chǔ)上,實驗探索了hAMSCs在微載體和生物反應(yīng)器系統(tǒng)中擴(kuò)增時細(xì)胞的增殖特性以及氧環(huán)境和換液頻率對hAMSCs擴(kuò)增以及擴(kuò)增后干細(xì)胞基因表達(dá)和維持成骨分化能力的影響,然后又以常規(guī)靜態(tài)誘導(dǎo)作為對照,考察了hAMSCs在生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)中的成骨誘導(dǎo)分化特性。研究發(fā)現(xiàn),生物反應(yīng)器微載體技術(shù)應(yīng)用于hAMSCs規(guī)模化擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)比常規(guī)靜態(tài)培養(yǎng)方式具有明顯的優(yōu)勢。hAMSCs在生物反應(yīng)器常氧環(huán)境下擴(kuò)增時細(xì)胞密度可達(dá)6.88×105 cells/ml,遠(yuǎn)高于孔板靜態(tài)擴(kuò)增時的最高細(xì)胞密度(2.13×105 cells/ml)。在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增hAMSCs時采用低氧條件,比常氧條件更有利于hAMSCs增殖、維持更高的干細(xì)胞基因Oct-4和Nanog基因表達(dá)水平以及其成骨分化潛能。然而,低氧條件下擴(kuò)增細(xì)胞易產(chǎn)生大量的乳酸,通過每天換液可以降低培養(yǎng)基中的乳酸濃度,可望進(jìn)一步優(yōu)化生物反應(yīng)器低氧擴(kuò)增環(huán)境。實驗發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境下擴(kuò)增每天換液較每1.5 d換液更有利于hAMSCs增殖及擴(kuò)增后干細(xì)胞基因Oct-4的基因表達(dá),但對成骨分化潛能的維持沒有顯著影響。另外,與常規(guī)靜態(tài)誘導(dǎo)分化方式相比,在hAMSCs的成骨誘導(dǎo)分化過程中應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)能夠提高轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix基因的表達(dá)水平,進(jìn)而促進(jìn)其下游基因產(chǎn)物如Ⅰ型膠原、骨橋蛋白、骨鈣素等成骨特征蛋白的表達(dá)和胞外鈣結(jié)節(jié)的形成。 通過以上研究,本文對體外培養(yǎng)環(huán)境中代謝副產(chǎn)物乳酸影響hAMSCs體外擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化的現(xiàn)象及其作用機(jī)制有了較為深入的認(rèn)識,并初步建立了面向臨床應(yīng)用的生物反應(yīng)器規(guī)模化擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化技術(shù)。研究結(jié)果不但有助于理解體外培養(yǎng)環(huán)境與hAMSCs擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化等生物學(xué)特性之間的有機(jī)聯(lián)系,也有助于進(jìn)一步認(rèn)識體內(nèi)微環(huán)境調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制,為后續(xù)應(yīng)用生物反應(yīng)器微載體系統(tǒng)規(guī)模化擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)hAMSCs奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：1424001