發(fā)布時間：2018-01-06 10:18

  本文關(guān)鍵詞：TGF-β1在雷奈酸鍶促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化中的作用　出處：《南方醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：研究目的 雷奈酸鍶(Strontium ranelate,Sr)是一種用于治療骨質(zhì)疏松的新型藥物,它具有使大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)向成骨細胞方向轉(zhuǎn)化的作用,除此之外,它還有改善骨強度,促進新生血管形成等其它重要的功能。研究表明Sr可通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2,ERK1/2)和P38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路調(diào)節(jié)成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2(Cbfal)的轉(zhuǎn)錄活性,Runx2則調(diào)節(jié)下游成骨基因,如骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、Ⅱ型膠原(Collagen type Ⅱ,COL Ⅱ)的表達,促進BMSCs的成骨分化。 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成員之一,它有著極其廣泛的生物學功能,不僅調(diào)控rBMSCs的生長發(fā)育和分化,而且能促進rBMSCs向成骨細胞的發(fā)育和轉(zhuǎn)化,調(diào)控成骨細胞的生長發(fā)育和增殖,在合成骨基質(zhì)和形成骨重建方面也起著重要的作用,是調(diào)控rBMSCs生長發(fā)育和向成骨細胞分化的首選的生長因子之一；它還可參與調(diào)控多種細胞的生長發(fā)育和生物學功能。相關(guān)資料表明,TGF-β1可能在鍶促進rBMSCs向成骨細胞分化的過程中起著重要的作用。但是,TGF-β1在Sr促進rBMSCs向成骨細胞分化中的作用如何迄今未見報道。本文旨在重點探討：①Sr對rBMSCs的TGF-β1表達的影響；②TGF-β1是否在Sr促進rBMSCs向成骨細胞分化中起作用,以便為Sr的促成骨作用機制提供新穎的實驗資料。 研究方法 1.建立rBMSCs體外分離、培養(yǎng)的方法體系。 取四周齡,雌雄不限SD大鼠,取出大鼠雙側(cè)的股骨,脛骨,用全骨髓貼壁的方法分離出rBMSCs,用含培養(yǎng)液的10m1注射器從大鼠骨髓中將rBMSCs從骨髓中沖洗出來,直至骨髓腔發(fā)白,將收集好的細胞懸液離心,去上清,置于25cm2培養(yǎng)瓶中,并于37℃、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng),當細胞鋪滿瓶底80%左右時進行傳代培養(yǎng)和適當?shù)膬龃�。并取�?-5代的細胞用于實驗。用倒置顯微鏡觀察細胞生長發(fā)育狀態(tài),并鑒定所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。 2.定向誘導rBMSCs向成骨細胞分化 取生長狀態(tài)良好的第3-5代rBMSCs,調(diào)整其濃度為105/ml左右,取細胞懸液4ml接種,并用成骨誘導液(含10-8的地塞米松,0.2mM的維生素C,10mMβ-甘油磷酸鈉)培養(yǎng),當細胞融合達到60%-70%時,進行實驗操作。 3.實驗分組 (1)堿性磷酸酶(ALP)指標測定的實驗分組 ①分為六組,分別設(shè)不同的濃度誘導rBMSCs,分別為對照組、Sr=0.1、Sr=l、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM,每組設(shè)5復孔,六組均在成骨誘導液條件下誘導rBMSCs7天。當Sr=3mM時,ALP活性最大。 ②分為五組,分別為對照組：成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：3mM Sr+成骨誘導液培養(yǎng)；Sr+SB組：Sr+SB431542+成骨誘導液：先用10gmol/L SB431542(TGF-β1抑制劑)預處理rBMSCs2小時,然后加3mM Sr；SB431542組：SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO組：DMSO+成骨誘導液,用10μmol/LDMSO培養(yǎng)；共培養(yǎng)rBMSCs7天,測定ALP活性。 (2)茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色的實驗分組 ①分為兩組,分別設(shè)不同的濃度誘導rBMSCs。對照組：用成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：3mM Sr+成骨誘導液,共培養(yǎng)21天。 ②分為五組,分別為對照組：成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：3mM Sr+成骨誘導液；Sr+SB431542組：Sr+SB431542+成骨誘導液,先用10gmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時,然后加3mM Sr；SB431542組：SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO+成骨誘導液組：用10μmol/LDMSO培養(yǎng)：共培養(yǎng)rBMSCs21天,測定鈣結(jié)節(jié)數(shù)目。 (3)TGF-β1蛋白表達的實驗分組 ①分為六組,分別設(shè)不同的濃度誘導rBMSCs.分為對照組、Sr=0.1、Sr=1、Sr=3、Sr=5、Sr=7mM六組,在成骨誘導液中培養(yǎng)7天。當Sr=l mM時,TGF-β1蛋白表達最高。 ②分為六組,分別設(shè)不同的時間誘導rBMSCs.分為對照組、t=1、t=3、t=5、t=7、t=10天六組。各組中所用Sr=l mM。當t=7天時,TGF-β1蛋白表達最高。 ③分為五組,分別為對照組：用成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：1mM Sr+成骨誘導液；Sr+SB431542組：Sr+SB431542+成骨誘導液,先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時,然后加1mM Sr；SB431542組：10μmol/L SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO組：DMSO+成骨誘導液,用10μmol/LDMSO培養(yǎng)；共培養(yǎng)rBMSCs7天,用western-blot檢測TGF-β1蛋白表達情況。 (4) Runx2mRNA表達情況分組 ①分為六組,分別設(shè)不同的濃度誘導rBMSCs。對照組、Sr=1、Sr=2、Sr=5、Sr=7、Sr=10mM六組,在成骨誘導液中培養(yǎng)7天。當Sr=l mM時,Runx2mRNA表達最高。 ②分為八組,分別設(shè)不同的時間誘導rBMSCs。對照組、t=0.5h、t=1h、t=2h、t=4h、t=3d、t=7d、t=14d。各組所用Sr=l mM。當t=7天時,Runx2mRNA表達最高。 ③分為五組,分別為對照組：用成骨誘導液培養(yǎng)；Sr組：1mM Sr+成骨誘導液；Sr+SB431542組：Sr+SB431542+成骨誘導液,先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時,然后加1mM Sr；SB431542組：10μmol/L SB431542+成骨誘導液：先用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs2小時；DMSO組：DMSO+成骨誘導液,用10μmol/LDMSO培養(yǎng)；共培養(yǎng)rBMSCs7天,PT-PCR檢測Runx2mRNA表達情況。 研究結(jié)果 1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察 倒置相差顯微鏡觀察顯示：rBMSCs的接種初期可見大量圓形的懸浮細胞。隨培養(yǎng)時間的延長,細胞形狀漸趨向于多角形或梭形,大多數(shù)細胞在24小時之內(nèi)貼壁,這一代細胞為原代細胞,當原代細胞培養(yǎng)至一星期左右時,細胞貼壁可達70%-80%；經(jīng)過多次細胞換液后,我們發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)逐漸趨向一種,呈成纖維樣細胞,當細胞逐漸融合之后,呈漩渦狀、輻射狀。當細胞融合至80%左右,應(yīng)按1：2的比例傳代。 2、Sr增加rBMSCs的ALP活性 應(yīng)用濃度分別為0、0.1、1、3、5、7mM的Sr分別處理rBMSCs7天,測定ALP的OD值。應(yīng)用單因素方差分析顯示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=44.092,P0.001),各組與對照組相比均能增加rBMSCs ALP活性(P0.05),其中當Sr的濃度為3mM時,rBMSCsALP活性的作用最大,與各組相比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在用3mM Sr處理細胞前2小時,應(yīng)用10μmol/LSB431542預處理rBMSCs,共培養(yǎng)7天,測定ALP的OD值。應(yīng)用單因素方差分析顯示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=5.053,P0.001)。應(yīng)用3mM Sr處理細胞7天可明顯增加ALP活性,與各組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),在用3mM Sr處理細胞前2小時,應(yīng)用10μmol/L SB431542預處理rBMSCs,可明顯地抑制Sr對ALP活性的促進作用,與Sr組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),對照組、SB431542組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3、Sr促進rBMSCs的鈣結(jié)節(jié)形成 應(yīng)用濃度分別為0、3mM Sr分別處理rBMSCs21天。應(yīng)用獨立樣本T檢驗顯示當我們用3mM Sr作用rBMSCs21天時,可明顯增加鈣結(jié)節(jié)數(shù)量,與對照相比較有統(tǒng)計學差異(t=-9.865,P0.001)；在3mM Sr處理rBMSCs前2小時,10μtmol/L SB431542預處理細胞2小時,共培養(yǎng)21天。用單因素方差分析顯示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=19.161,P0.001),Sr組可明顯增加鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量,與任意一組比較均有統(tǒng)計學意義(P0.05),在3mM Sr處理rBMSCs前2小時,10μmol/L SB431542預處理細胞2小時能明顯地抑制Sr對鈣結(jié)節(jié)形成的促進作用,兩組相比有統(tǒng)計學差異(P0.05),對照組、SB組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 4、Sr對rBMSCs TGF-β1蛋白表達的影響 應(yīng)用0、0.1、1、3、5、7mM Sr分別處理rBMSCs7天。用單因素方差分析示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=583.858,P0.001),0.1-5mM Sr各組較均可顯著地上調(diào)TGF-β1的表達,與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中當Sr濃度為1mM時,TGF-β1表達達到高峰,與各組相比有統(tǒng)計學差異(P0.05),但當Sr=7mM時,Sr對TGF-β1表達無明顯作用,與對照組比較,無統(tǒng)計學差異(P0.05)；在1到10天的時間范圍內(nèi),用1mM Sr誘導細胞。用Welch校正法可知總體均數(shù)間有統(tǒng)計學差異(P0.001),各組呈時間依賴性地促進TGF-β1表達,在第7天時TGF-β1表達達到高峰,與各組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),第10天時Sr對TGF-β1的表達無明顯增加,與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P0.05)；應(yīng)用1mM Sr處理rBMSCs前2小時,給予10μmol/L SB431542預處理,共培養(yǎng)7天。用單因素方差分析示總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=314.375,P0.001),其中1mM Sr可明顯的促進TGF-β1的表達,與其余各組比較,有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),加入SB431542后可明顯地抑制Sr對TGF-β1表達的上調(diào)作用,兩組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),對照組、SB組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 5、Sr對rBMSCs Runx2mRNA表達的影響 應(yīng)用0、1、2、5、7、10mM Sr分別處理rBMSCs7天。用單因素方差分析可知總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=985.949,P0.001),應(yīng)用1-5mM Sr時可顯著地上調(diào)Runx2mRNA的表達,其中濃度為1mM時,Runx2mRNA表達達到高峰,與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P0.01),當Sr=7和Sr=10mM時,Runx2mRNA表達均明顯下降,與對照組比較有統(tǒng)計學差異(P0.01)；在0.5小時-14天的時間范圍內(nèi),1mM Sr培養(yǎng)細胞。用單因素方差分析可知總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=353.551,P0.001),Sr呈時間依賴性地促進Runx2mRNA表達,在第7天時Runx2mRNA表達達到高峰,與其余各組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)；在應(yīng)用1mM Sr處理rBMSCs前2小時,給予10μmol/L SB431542預處理,共培養(yǎng)7天。單因素方差分析可知總體均數(shù)間有顯著統(tǒng)計學差異(F=5510.983,P0.001),1mM Sr可明顯的促進Runx2mRNA表達,與對照組相比(P0.01),加入阻斷劑后可明顯地抑制Sr對Runx2mRNA表達的上調(diào)作用,兩組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01),對照組、SB組、DMSO組三組間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 結(jié)論 1、應(yīng)用全骨髓貼壁法分離、提純、培養(yǎng)rBMSCs較其它方法安全、方便；rBMSCs在應(yīng)用成骨誘導液培養(yǎng)條件下,可向成骨細胞分化,具有成骨分化的潛能。 2、Sr可較好的誘導rBMSCs分化為成骨細胞,此作用可能與其上調(diào)TGF-β1-Runx2表達有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：1387436