本文關(guān)鍵詞：表達HIV-1gag基因的重組腺病毒疫苗的藥效學(xué)研究　出處：《北京工業(yè)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：艾滋�。ˋIDS），是當(dāng)今對人類健康威脅最大的疾病之一，自從引起艾滋病的HIV病毒被發(fā)現(xiàn)以來，科學(xué)家們始終致力于尋找科學(xué)有效的預(yù)防和治療手段，但由于HIV本身高度變異性及易于產(chǎn)生耐藥性的特點，至今仍然沒有研制出治愈艾滋病的有效藥物。從疾病控制長遠(yuǎn)戰(zhàn)略來說，有效的HIV疫苗才是戰(zhàn)勝HIV流行的最佳希望。本課題組前期進行了多載體HIV疫苗序貫及重復(fù)免疫的研究，接受免疫的動物體內(nèi)可長期維持高水平細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究主要對表達gag基因的重組腺病毒疫苗（Ad5-HIVgag）進行臨床前藥效學(xué)研究，，為該疫苗的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 腺病毒載體一直是基因治療和疫苗研究的熱點，這主要是由于腺病毒載體具有安全性高、宿主范圍廣泛、感染滴度高、穩(wěn)定性好，腺病毒雙鏈DNA基因組易于重組基因操作等特點。核心蛋白Gag具有較高的保守性，富含CTL表位，是細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要靶標(biāo)。Ad5-HIVgag疫苗是插入了HIV-1gag基因的、缺失病毒E1及E3區(qū)的非復(fù)制型5型重組腺病毒。疫苗中g(shù)ag基因來自HIV-1B亞型gag共享序列。 本研究首先對Ad5-HIVgag疫苗檢定的PCR方法、酶切方法、Western blot方法及ELISpot方法進行了方法學(xué)驗證并制定了相應(yīng)的質(zhì)量檢定規(guī)程。對純化的三批重組Ad5-HIVgag疫苗制品進行了相應(yīng)的質(zhì)量檢定。用PCR方法可以擴增出gag特異性產(chǎn)物，酶切方法證明HIV-1gag基因插入位置正確，Western blot方法證實Gag蛋白可以有效表達，免疫小鼠后用ELISpot方法可檢測到Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。 本研究重點評價了小鼠及猴體內(nèi)的細(xì)胞免疫反應(yīng)效果。用不同劑量的Ad5-HIVgag疫苗（2×10~6VP/只/次、2×10~7VP/只/次、2×10~8VP/只/次、2×10~9VP/只/次、2×10~(10)VP/只/次）局部肌肉注射小鼠兩次或三次，最后一次免疫后1周用ELISpot方法檢測Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。結(jié)果2×10~6VP的劑量就可以在小鼠體內(nèi)獲得明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答。以2×10~7VP的劑量注射產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)水平最高，當(dāng)高于此劑量時，細(xì)胞免疫水平反而降低。為觀察Ad5-HIVgag疫苗在食蟹猴體內(nèi)所引起的特異性免疫反應(yīng)，在猴長毒試驗過程中同時進行了藥效學(xué)觀察。分別使用低（0.99×1011VP/只/次）、中（4.94×1011VP/只/次）、高（24.68×1011VP/只/次）不同的病毒劑量，肌肉注射食蟹猴，于0、3、6、9、12周各肌肉注射1次。于不同時間點用ELISpot方法檢測疫苗誘導(dǎo)的Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時也檢測了動物血清抗腺病毒的中和抗體。結(jié)果從初次免疫后5周開始，免疫的動物即檢測到了Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，隨著時間的延長，8周時Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平有增加。12周時Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平有所下降，但隨后15周及18周的檢測，Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)水平又有升高。說明，食蟹猴在一定的劑量范圍內(nèi)用Ad5-HIVgag免疫后，可產(chǎn)生針對Gag的特異性免疫反應(yīng)。三個實驗組動物都檢測到了較高水平的腺病毒中和抗體，但是對Ad5疫苗反復(fù)應(yīng)用誘導(dǎo)的Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制作用并不明顯。 總之，Ad5-HIVgag疫苗可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生Gag特異性T細(xì)胞應(yīng)答，有可能成為治療艾滋病的有效疫苗。依據(jù)國家對生物制品注冊的管理規(guī)定，對Ad5-HIVgag疫苗相關(guān)的質(zhì)量研究及藥效學(xué)研究資料進行了整理，并已向北京市藥品監(jiān)督管理局遞交了Ⅰ期臨床研究申請。
[Abstract]:AIDS ( AIDS ) is one of the greatest threats to human health . Since AIDS - induced HIV virus has been discovered , scientists have been working to find effective drugs to prevent and cure AIDS . In the long - term strategy of disease control , effective HIV vaccine is the best hope to overcome the HIV epidemic . In the early stage of this study , effective HIV vaccine is the best hope to overcome the HIV epidemic . The adenovirus vector has been a hot spot for gene therapy and vaccine research , which is mainly characterized by high safety , wide host range , high infection titer , good stability , easy recombination gene operation of adenovirus double - stranded DNA genome . The core protein Gag has high conservative property and CTL epitopes , and is the main target of cellular immune response . The Ad5 - HIV gag vaccine is a non - replicating type 5 recombinant adenovirus inserted with HIV - 1 gag gene and deleted virus E1 and E3 region . The gag gene of the vaccine is from gag shared sequence of HIV - 1B subtype . In this study , the PCR method , enzyme - cutting method , Western blot method and pot method of Ad5 - HIV gag vaccine were verified and the corresponding quality test procedure was established . The specific product of gag was amplified by PCR . The method of PCR proved that the inserted position of HIV - 1 gag gene was correct , and Western blot was used to demonstrate that Gag protein could be expressed effectively , and the immune response of Gag - specific cell could be detected after immunized mice . The specific immune responses of Gag - specific cells were detected in mice at different time points . The results showed that the immune response of Gag - specific cells was observed at the dose of 2 脳 10 ~ 7 VP . In conclusion , the Ad5 - HIV gag vaccine can induce the organism to produce Gag - specific T cell response , which may become an effective vaccine to treat AIDS . According to the State regulations on the registration of biological products , the quality research and pharmacodynamics research data related to the Ad5 - HIV gag vaccine have been collated and submitted to the Beijing Drug Administration Bureau for application for clinical study .

【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：1387425