發(fā)布時間：2018-01-06 11:08

  本文關鍵詞：間充質干細胞的成神經分化影響了其對肝細胞生長因子的趨化遷移效應　出處：《蘇州大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：惡性膠質瘤是目前顱內最為常見的原發(fā)腦瘤，它具有極強的浸潤和擴散的特性。目前，最常用的治療手段無非外科手術切除和放療或化療的結合，但效果并不盡如人意，而干細胞移植極有希望治療膠質瘤。因骨髓間充質干細胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體內體外均顯示很強的膠質瘤趨化性及可以向多種趨化因子（SDF、SCF、VEGF、HGF）遷移，并且具有多向分化潛能，所以應用BMSCs治療膠質瘤即是很好的細胞治療手段。本實驗旨在研究肝細胞生長因子（HGF）對不同分化狀態(tài)下BMSCs的遷移以及相關信號通路MAPK和PI3K/Akt的影響。并且，我們還進一步研究了HGF對不同分化狀態(tài)下BMSCs的細胞骨架系統(tǒng)的變化以及磷酸化ERK1/2入核的情況。 本研究首先采用Percoll密度梯度離心法從大鼠骨髓中分離出BMSCs，體外擴增培養(yǎng)，通過觀察細胞形態(tài)、生長特性，免疫熒光染色，成骨、成脂誘導分化，對BMSCs進行鑒定。結果顯示，分離培養(yǎng)的BMSCs為長梭形，增殖速度快，表面抗原CD29、CD90、CD106呈陽性，CD34、CD45為陰性，并且體外能夠誘導分化為成骨細胞及脂肪細胞，證明分離培養(yǎng)的細胞是具有多向分化潛能的BMSCs。 隨后將傳到3代以上的細胞作為純度較高的BMSCs用作實驗材料，以2×104/ml的密度接種于35mm2培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中預先放置包被有0.05%多聚賴氨酸的蓋玻片，待細胞貼壁后，通過丁羥基茴香醚（butyl hydroxy anisol, BHA）聯(lián)合堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）誘導BMSCs成神經分化，即先用10ng/ml bFGF預誘導24h，再用200μM BHA和2%DMSO誘導5h，最后用含有N2的H-DMEM維持培養(yǎng)。觀察該過程中細胞的形態(tài)變化，免疫細胞化學染色檢測神經細胞特異性標志物nestin、β-III tubulin及MAP2的表達變化。結果顯示，未分化BMSCs呈成纖維細胞樣；預誘導24h后，胞體稍有收縮，邊緣變得不齊整；誘導5h，胞體收縮成圓形或橢圓形，折光性強，有突起伸出；維持培養(yǎng)18h后，細胞出現(xiàn)3個或更多突起；維持培養(yǎng)48h，細胞突起更為復雜，出現(xiàn)二級分叉，突起長度增加，與其他細胞的突起相互接觸。免疫熒光染色顯示，nestin的表達在未分化間充質干細胞表達最高，隨著成神經分化過程的進行逐漸降低。而β-III tubulin的表達在誘導5小時的細胞中開始出現(xiàn)，維持18小時和48小時階段的細胞中有較弱的表達。整個分化過程中，MAP2都沒有表達。 接下來我們研究了不同分化狀態(tài)下MSCs向HGF的遷移效應。我們首先利用Boyden chamber裝置研究不同分化狀態(tài)下BMSCs向不同濃度即0、5、25、50和100ng/ml的HGF的遷移，先對未分化BMSC進行遷移實驗，發(fā)現(xiàn)HGF誘導的BMSCs的遷移呈現(xiàn)劑量依賴效應，HGF在50ng/ml時細胞達到最大遷移數(shù)量，為了研究這一種遷移是化學趨化性還是化學機動性引起的，我們將上室和下室均加入相同濃度的HGF發(fā)現(xiàn)與對照L-DMEM相比無明顯差異，證實HGF誘導的遷移是化學趨化性引起的，接著我們對成神經分化的不同階段細胞進行群體性遷移研究，結果發(fā)現(xiàn)，50ng/ml的HGF均能引起各個狀態(tài)細胞明顯的遷移，，25ng/ml的HGF明顯引起了誘導5h、維持18h和48h階段細胞的遷移，我們也證實了這些分化階段細胞的遷移仍是化學趨化引起的。另外，我們還研究了不同分化階段細胞向同一濃度HGF遷移數(shù)量的比較，發(fā)現(xiàn)預誘導24h階段的細胞向50ng/mlHGF遷移的數(shù)量更多，相比其他分化階段有更明顯的趨化效應。我們對遷移至膜下的細胞也進行了免疫熒光染色的鑒定，結果發(fā)現(xiàn)在所有的分化階段，遷移至膜下的細胞中nestin陽性的細胞占絕大多數(shù)。并且HGF明顯加強了nestin陽性細胞的遷移，而對β-III tubulin陽性的細胞沒有明顯作用。另外，與先前的結果一致的是，50ng/ml HGF明顯加強了預誘導24小時階段nestin陽性細胞的遷移。 此外，我們還運用Dunn chamber裝置研究了BMSCs及成神經分化不同狀態(tài)下BMSCs向HGF的趨化性遷移，計算細胞遷移速率和遷移效率。結果顯示，在趨化性遷移實驗中，即外槽加入不同濃度HGF、內槽只加L-DMEM時，相比誘導5h、維持18h及48h，未分化及預誘導24h細胞的遷移速度呈現(xiàn)明顯的加快。而當內外槽均加入50ng/ml HGF，細胞的遷移速率及遷移效率與對照相比無差異。另外，我們還研究了成神經分化各個階段細胞的遷移速率，實驗發(fā)現(xiàn)：當外槽都加入50ng/ml的HGF時，預誘導24h階段的細胞相比其他分化階段的細胞呈現(xiàn)出更高的遷移效率。 MAPKs家族包括ERK1/2、p38MAPKs及SAPK/JNK，而Akt是PI3K信號通路的下游關鍵蛋白。已經有很多文獻證實PI3K和MAPK信號通路參與體內諸多生化反應如細胞分裂、凋亡、分化及遷移。并且有文獻報道HGF可以激活一些重要的信號通路分子，如ERK1/2、PI3K/Akt和p38MAPK。接下來我們應用蛋白印跡檢測了HGF對不同分化狀態(tài)下BMSCs中ERK1/2、Akt、p38MAPK及SAPK/JNK表達的影響。首先，我們用不同濃度的HGF處理未分化狀態(tài)下的BMSCs，我們發(fā)現(xiàn)HGF誘導的ERK1/2、Akt和p38MAPK的磷酸化呈現(xiàn)濃度依賴效應。而HGF對SAPK/JNK的磷酸化沒有影響。為了進一步研究HGF對兩條信號通路的影響，我們選取了50ng/ml的HGF處理不同分化狀態(tài)下BMSCs不同時間后，觀察相關蛋白的磷酸化情況。結果發(fā)現(xiàn)，不同分化狀態(tài)下的細胞均表達基底水平的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK，然而HGF所誘導的Akt的磷酸化的增加發(fā)生在未分化，預誘導24h和誘導5h階段，并且這種磷酸化的增加從15分鐘開始，一直持續(xù)到60分鐘。在未分化和預誘導24小時狀態(tài)的細胞中，HGF誘導的ERK1/2的磷酸化的增加從5分中開始，15分鐘時達到峰值，而在30分鐘內恢復到基底水平。而在誘導5小時、維持18小時和48小時的細胞中，這種增強的ERK1/2的磷酸化會持續(xù)到60分鐘。對于p38MAPK的磷酸化，HGF刺激后，在未分化、預誘導24小時及誘導5小時的細胞中5分鐘時開始增加，15分鐘時達到峰值，而在維持18及48小時的細胞中卻沒有明顯變化。HGF刺激不同分化狀態(tài)的細胞后，SAPK/JNK增加的磷酸化發(fā)生在誘導5小時、維持18及48小時的細胞中。此外，我們也研究了五種狀態(tài)的細胞中的Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK基底水平的表達，結果發(fā)現(xiàn)，誘導5h和維持18h階段磷酸化的ERK1/2明顯高于其他階段的細胞。而磷酸化的Akt在未分化的間充質干細胞中表達最高，隨著細胞成神經分化的誘導，磷酸化的p38MAPK和SAPK/JNK的表達逐漸升高。 最后，為了進一步證實HGF誘導的不同狀態(tài)的細胞的遷移所參與的信號通路，我們引入了Akt、ERK1/2、p38MAPK和SAPK/JNK信號分子的抑制劑LY294002、SB203580、PD98059和SP600125，即分別用四種信號分子的抑制劑預處理細胞后檢測細胞向HGF的遷移情況。首先，利用Boyden chamber研究抑制劑預處理后細胞的群體遷移行為，發(fā)現(xiàn)PD98059阻斷ERK1/2后明顯的抑制了HGF誘導的所有狀態(tài)細胞的遷移，特異阻斷PI3K/Akt后，僅未分化階段的細胞向HGF的遷移受到抑制，而分化階段細胞的遷移沒有受到明顯抑制。當p38MAPK被阻抑后，只影響了未分化、預誘導24h和誘導5h階段的細胞遷移，而SAPK/JNK被阻斷后，維持18h和48h階段的細胞遷移相應的受到了抑制。緊接著，我們又利用Dunnchamber裝置進一步研究了抑制劑摻入后細胞在個體水平遷移速度和遷移效率的變化。結果發(fā)現(xiàn)，ERK1/2被抑制后，所有狀態(tài)細胞的遷移速度及效率都受到了明顯的抑制。抑制PI3K/Akt后明顯抑制了未分化和預誘導24h階段細胞的遷移速度及未分化、預誘導24h和誘導5h階段細胞的遷移效率。阻斷p38MAPK后，未分化、預誘導24h和誘導5h階段的細胞遷移速度及遷移效率均明顯降低。對于SAPK/JNK受到抑制后，誘導5h，維持18h和48h細胞的遷移速度及遷移效率都明顯下降了。以上結果說明不同信號通路的分子在特定狀態(tài)的細胞向HGF的遷移中發(fā)揮了重要的作用。 細胞骨架的重組和細胞遷移是密切相關的。并且，當細胞所處環(huán)境存在趨化物時，細胞遷移需要極性的改變，并且細胞遷移的能力很大程度上取決于細胞骨架重組的能力。因此，我們也分析了HGF刺激后不同分化狀態(tài)下BMSCs細胞骨架的重組。我們發(fā)現(xiàn)處于未分化及預誘導24小時階段的細胞在HGF刺激0.5min時骨架便開始明顯發(fā)生重組，細胞周邊出現(xiàn)肌動蛋白聚集而形成的尾足；而在誘導5小時細胞中，細胞骨架的重組發(fā)生在HGF刺激后大約1min，在維持18h和48h階段的細胞中，細胞骨架的重組發(fā)生在HGF刺激后大約1.5min，這說明隨著分化的進行細胞骨架的重組對HGF的刺激敏感性下降。 綜上，HGF能夠趨化不同分化狀態(tài)下BMSCs的定向遷移，PI3K/Akt和MAPKs信號通路參與介導了這些過程；成神經分化的BMSCs趨向HGF的遷移能力與其分化狀態(tài)密切相關，不同的信號通路介導了不同分化狀態(tài)的細胞向HGF的遷移。并且，HGF誘導的MSCs的細胞骨架的重組也與細胞的分化狀態(tài)密切相關。本研究為進一步揭示BMSCs的定向遷移機制及臨床應用BMSCs進行移植提供了理論基礎。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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1 包普花;王敏;蘇軍;劉孟宇;張煥相;;成神經分化的骨髓間充質干細胞向C6細胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α的趨化性遷移研究[J];細胞與分子免疫學雜志;2009年09期

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本文編號：1387585