本文關(guān)鍵詞：腎缺血再灌注損傷模型大鼠腎臟組織中EC-SOD的表達(dá)變化　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是臨床治療過程中一種常見的病理生理反應(yīng),多見于腎臟移植或急性腎動(dòng)脈阻斷等治療過程中。RIRI也是導(dǎo)致腎移植病人術(shù)后功能恢復(fù)延遲,甚至發(fā)生急性腎功能衰竭增加患者死亡率的重要因素。研究發(fā)現(xiàn):在到達(dá)腎臟的血流被暫時(shí)性阻斷,隨后又恢復(fù)其血液供應(yīng)重新充氧的過程中,會(huì)有大量的活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,導(dǎo)致腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)。這也是引發(fā)缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H_2O_2)等。ROS的化學(xué)性質(zhì)非�；顫�,可以與細(xì)胞內(nèi)的功能蛋白質(zhì)、DNA和胞膜上的脂類等生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡和死亡,加劇腎臟組織損傷。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,負(fù)責(zé)清除O2-,它能通過歧化反應(yīng)將O2-轉(zhuǎn)化成氧,但同時(shí)也產(chǎn)生了副產(chǎn)品H_2O_2。SOD在機(jī)體清除ROS的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)SOD共有三種亞型:錳-SOD(Mn-SOD)存在于線粒體,銅鋅-SOD(Cu/Zn-SOD)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。細(xì)胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是唯一位于細(xì)胞外的SOD亞型,并通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin-binding domain,HBD)與細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合。其次,EC-SOD也存在于細(xì)胞外液,如血清,腦脊髓液,腹水和滑膜液等。以往對(duì)于SOD的功能研究主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。EC-SOD在腎臟缺血再灌注損傷模型的表達(dá)如何變化,是否也發(fā)揮了抗氧化作用,有待研究。本研究采用無損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24小時(shí)后觀察腎組織內(nèi)H_2O_2含量、MDA含量,以及抗氧化酶EC-SOD基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化,進(jìn)一步證實(shí)腎臟缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制,以及EC-SOD在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用,為防治腎缺血再灌注損傷提供一條新思路。目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激水平,以及抗氧化酶EC-SOD的基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化,進(jìn)一步證實(shí)腎臟缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制,以及抗氧化酶EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。方法:1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材雄性wister大鼠12只,體重200±10g,購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,隨機(jī)分為對(duì)照組(control)和腎臟缺血再灌注損傷組(riri),每組各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。riri組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動(dòng)脈,在靠近腎門處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45mins后松開動(dòng)脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),肉眼可見腎動(dòng)脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對(duì)照組大鼠開腹后只切除右腎,分離左腎動(dòng)脈,但不夾閉左腎動(dòng)脈。24小時(shí)后收集血液,3000rpm離心10min,分離血清用于肌酐(serumcreatinine,scr)、血尿素氮(bloodureanitrogen,bun)濃度測定;處死大鼠取腎臟,將一部分腎臟于4%多聚甲醛中固定進(jìn)行he染色,觀察腎臟的形態(tài)學(xué)改變。將另一部分腎臟置于液氮中用于EC-SODmrna和蛋白水平測定以及丙二醛(malondialdehyde,mda)和H_2O_2含量測定。2測定指標(biāo)及方法2.1血清scr和bun水平測定血清scr濃度采用苦味酸法測定;血清bun濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。2.2he染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。2.3大鼠腎組織mda含量測定將從-70℃冰箱中取出的腎組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/l磷酸鉀緩沖液,ph7.4,1mmol/l鹽酸苯甲脒,1mmol/lpmsf,0.1%tween-20,0.5mol/lnacl,1mmol/ledtana3,5mmol/lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm4℃離心20min,取上清即制成10%腎組織勻漿,勻漿內(nèi)mda含量采用南京建成丙二醛(mda)測定試劑盒測定。2.4大鼠腎組織H_2O_2含量測定將從-70℃冰箱中取出的腎組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/l磷酸鉀緩沖液,ph7.4,1mmol/l鹽酸苯甲脒,1mmol/lpmsf,0.1%tween-20,0.5mol/lnacl,1mmol/ledtana3,5mmol/lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm4℃離心20min,取上清即制成10%腎組織勻漿。勻漿內(nèi)H_2O_2含量采用鉬酸比色法測定,以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/gpro)表示。2.5大鼠腎組織EC-SODmrna水平測定用trizol法提取腎組織總rna。約3μg總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。以gapdh為內(nèi)對(duì)照,進(jìn)行rt-pcr。分別以EC-SOD的擴(kuò)增產(chǎn)物與gapdh灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量2.6大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平測定采用westernblot法測定大鼠腎組織內(nèi)抗氧化酶EC-SOD的蛋白表達(dá)水平。將大鼠腎組織制成勻漿,離心后取上清。采用改良lowry法測定其蛋白總量.電泳的蛋白上樣量為63ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在pvdf膜上加入兔抗EC-SOD抗體,室溫靜置過夜。經(jīng)洗膜后再加入熒光標(biāo)記的抗兔igg二抗。經(jīng)雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。結(jié)果:1大鼠腎組織的形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而riri組大鼠可見腎血管球萎縮,體積變小;腎小囊腔擴(kuò)張;腎小管管腔明顯擴(kuò)張,個(gè)別近曲小管上皮細(xì)胞水腫,胞漿疏松化;腎間質(zhì)水腫,腎小管間隙擴(kuò)大;集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、上皮水腫等改變。2血清scr水平con組大鼠血清中scr的濃度為103.444±8.465μmol/l,而riri組血清scr的濃度為131.153±17.814μmol/l。riri組大鼠血清scr濃度明顯高于con組(p0.05)。3血清bun水平con組大鼠血清bun的濃度為4.462±0.541mmol/l,而riri組血清bun的濃度為13.685±4.397mmol/l。riri組大鼠血清bun的濃度明顯高于con組(p0.05)。4腎組織勻漿內(nèi)mda的含量con組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的mda含量為9.15±1.53mmol/g,而riri組腎組織勻漿內(nèi)的mda含量為12.92±2.43mmol/g。riri組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的mda含量明顯高于con組(p0.01)。5大鼠腎組織勻漿內(nèi)H_2O_2的含量con組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量為11.92±1.9mmol/g,而riri組腎組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量為16.62±2.35mmol/g。riri組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量明顯高于con組(p0.01)。6大鼠腎組織EC-SODmrna的相對(duì)表達(dá)量采用rt-pcr的方法測定大鼠腎組織內(nèi)EC-SODmrna的相對(duì)表達(dá)量。con組大鼠腎組織內(nèi)EC-SODmrna的相對(duì)表達(dá)量為0.67±0.12,riri組腎組織內(nèi)EC-SODmrna的相對(duì)表達(dá)量為0.94±0.17,riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SODmrna水平明顯高于con組(p0.01)。說明riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的基因表達(dá)水平升高。7大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平con組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平為0.51±0.09,riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平為0.81±0.15。riri組EC-SOD蛋白水平明顯高于對(duì)照組(p0.01)。說明riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:1切除右腎后在靠近腎門處用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后,腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài),并已遭受過氧化損傷。3EC-SOD的基因和蛋白表達(dá)水平在riri模型組腎組織內(nèi)均明顯增強(qiáng)。表明EC-SOD可能參與了riri所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng),在腎組織內(nèi)發(fā)揮了抗氧化作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R692;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 Maurizio Salvadori;Giuseppina Rosso;Elisabetta Bertoni;;Update on ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation: Pathogenesis and treatment[J];World Journal of Transplantation;2015年02期

2 余曉東;廖波;鄧顯忠;姜果;朱平宇;魯棟梁;唐鐵龍;楊雪松;陳雙全;程樹林;;一種新型實(shí)用的大鼠腎缺血再灌注損傷模型的建立[J];重慶醫(yī)學(xué);2011年13期

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本文編號(hào)：1369949