本文關(guān)鍵詞：腎缺血再灌注損傷模型大鼠腎臟組織中EC-SOD的表達變化　出處：《河北醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是臨床治療過程中一種常見的病理生理反應(yīng),多見于腎臟移植或急性腎動脈阻斷等治療過程中。RIRI也是導致腎移植病人術(shù)后功能恢復(fù)延遲,甚至發(fā)生急性腎功能衰竭增加患者死亡率的重要因素。研究發(fā)現(xiàn):在到達腎臟的血流被暫時性阻斷,隨后又恢復(fù)其血液供應(yīng)重新充氧的過程中,會有大量的活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,導致腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)。這也是引發(fā)缺血再灌注損傷的重要機制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H_2O_2)等。ROS的化學性質(zhì)非常活潑,可以與細胞內(nèi)的功能蛋白質(zhì)、DNA和胞膜上的脂類等生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng),促進細胞凋亡和死亡,加劇腎臟組織損傷。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是機體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,負責清除O2-,它能通過歧化反應(yīng)將O2-轉(zhuǎn)化成氧,但同時也產(chǎn)生了副產(chǎn)品H_2O_2。SOD在機體清除ROS的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。在哺乳動物體內(nèi)SOD共有三種亞型:錳-SOD(Mn-SOD)存在于線粒體,銅鋅-SOD(Cu/Zn-SOD)主要位于細胞質(zhì)和細胞核。細胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是唯一位于細胞外的SOD亞型,并通過其肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heparin-binding domain,HBD)與細胞表面和細胞外基質(zhì)相結(jié)合。其次,EC-SOD也存在于細胞外液,如血清,腦脊髓液,腹水和滑膜液等。以往對于SOD的功能研究主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更強的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。EC-SOD在腎臟缺血再灌注損傷模型的表達如何變化,是否也發(fā)揮了抗氧化作用,有待研究。本研究采用無損傷動脈夾鉗夾腎動脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24小時后觀察腎組織內(nèi)H_2O_2含量、MDA含量,以及抗氧化酶EC-SOD基因水平和蛋白水平的表達變化,進一步證實腎臟缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激機制,以及EC-SOD在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用,為防治腎缺血再灌注損傷提供一條新思路。目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后腎臟內(nèi)的氧化應(yīng)激水平,以及抗氧化酶EC-SOD的基因水平和蛋白水平的表達變化,進一步證實腎臟缺血再灌注損傷的氧化應(yīng)激機制,以及抗氧化酶EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。方法:1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材雄性wister大鼠12只,體重200±10g,購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心,隨機分為對照組(control)和腎臟缺血再灌注損傷組(riri),每組各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。riri組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動脈,在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45mins后松開動脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),肉眼可見腎動脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對照組大鼠開腹后只切除右腎,分離左腎動脈,但不夾閉左腎動脈。24小時后收集血液,3000rpm離心10min,分離血清用于肌酐(serumcreatinine,scr)、血尿素氮(bloodureanitrogen,bun)濃度測定;處死大鼠取腎臟,將一部分腎臟于4%多聚甲醛中固定進行he染色,觀察腎臟的形態(tài)學改變。將另一部分腎臟置于液氮中用于EC-SODmrna和蛋白水平測定以及丙二醛(malondialdehyde,mda)和H_2O_2含量測定。2測定指標及方法2.1血清scr和bun水平測定血清scr濃度采用苦味酸法測定;血清bun濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。2.2he染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)olympus光學顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進行圖象分析。2.3大鼠腎組織mda含量測定將從-70℃冰箱中取出的腎組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/l磷酸鉀緩沖液,ph7.4,1mmol/l鹽酸苯甲脒,1mmol/lpmsf,0.1%tween-20,0.5mol/lnacl,1mmol/ledtana3,5mmol/lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm4℃離心20min,取上清即制成10%腎組織勻漿,勻漿內(nèi)mda含量采用南京建成丙二醛(mda)測定試劑盒測定。2.4大鼠腎組織H_2O_2含量測定將從-70℃冰箱中取出的腎組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/l磷酸鉀緩沖液,ph7.4,1mmol/l鹽酸苯甲脒,1mmol/lpmsf,0.1%tween-20,0.5mol/lnacl,1mmol/ledtana3,5mmol/lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm4℃離心20min,取上清即制成10%腎組織勻漿。勻漿內(nèi)H_2O_2含量采用鉬酸比色法測定,以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/gpro)表示。2.5大鼠腎組織EC-SODmrna水平測定用trizol法提取腎組織總rna。約3μg總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。以gapdh為內(nèi)對照,進行rt-pcr。分別以EC-SOD的擴增產(chǎn)物與gapdh灰度值之比表示目的基因的相對表達量2.6大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平測定采用westernblot法測定大鼠腎組織內(nèi)抗氧化酶EC-SOD的蛋白表達水平。將大鼠腎組織制成勻漿,離心后取上清。采用改良lowry法測定其蛋白總量.電泳的蛋白上樣量為63ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在pvdf膜上加入兔抗EC-SOD抗體,室溫靜置過夜。經(jīng)洗膜后再加入熒光標記的抗兔igg二抗。經(jīng)雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進行圖像數(shù)值分析。結(jié)果:1大鼠腎組織的形態(tài)學改變光學顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而riri組大鼠可見腎血管球萎縮,體積變小;腎小囊腔擴張;腎小管管腔明顯擴張,個別近曲小管上皮細胞水腫,胞漿疏松化;腎間質(zhì)水腫,腎小管間隙擴大;集合管出現(xiàn)管腔擴張、上皮水腫等改變。2血清scr水平con組大鼠血清中scr的濃度為103.444±8.465μmol/l,而riri組血清scr的濃度為131.153±17.814μmol/l。riri組大鼠血清scr濃度明顯高于con組(p0.05)。3血清bun水平con組大鼠血清bun的濃度為4.462±0.541mmol/l,而riri組血清bun的濃度為13.685±4.397mmol/l。riri組大鼠血清bun的濃度明顯高于con組(p0.05)。4腎組織勻漿內(nèi)mda的含量con組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的mda含量為9.15±1.53mmol/g,而riri組腎組織勻漿內(nèi)的mda含量為12.92±2.43mmol/g。riri組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的mda含量明顯高于con組(p0.01)。5大鼠腎組織勻漿內(nèi)H_2O_2的含量con組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量為11.92±1.9mmol/g,而riri組腎組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量為16.62±2.35mmol/g。riri組大鼠腎組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量明顯高于con組(p0.01)。6大鼠腎組織EC-SODmrna的相對表達量采用rt-pcr的方法測定大鼠腎組織內(nèi)EC-SODmrna的相對表達量。con組大鼠腎組織內(nèi)EC-SODmrna的相對表達量為0.67±0.12,riri組腎組織內(nèi)EC-SODmrna的相對表達量為0.94±0.17,riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SODmrna水平明顯高于con組(p0.01)。說明riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的基因表達水平升高。7大鼠腎組織EC-SOD蛋白水平con組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達水平為0.51±0.09,riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達水平為0.81±0.15。riri組EC-SOD蛋白水平明顯高于對照組(p0.01)。說明riri組大鼠腎組織內(nèi)EC-SOD的蛋白表達水平升高。結(jié)論:1切除右腎后在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后,腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài),并已遭受過氧化損傷。3EC-SOD的基因和蛋白表達水平在riri模型組腎組織內(nèi)均明顯增強。表明EC-SOD可能參與了riri所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng),在腎組織內(nèi)發(fā)揮了抗氧化作用。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692;R-332

【參考文獻】

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1 Maurizio Salvadori;Giuseppina Rosso;Elisabetta Bertoni;;Update on ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation: Pathogenesis and treatment[J];World Journal of Transplantation;2015年02期

2 余曉東;廖波;鄧顯忠;姜果;朱平宇;魯棟梁;唐鐵龍;楊雪松;陳雙全;程樹林;;一種新型實用的大鼠腎缺血再灌注損傷模型的建立[J];重慶醫(yī)學;2011年13期

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本文編號：1369949