本文關鍵詞：KCNQ2鉀通道的溫度調控機制研究　出處：《武漢大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：電壓依賴型鉀離子通道KCNQ2(Kv7.2)在調節(jié)神經系統(tǒng)興奮性方面發(fā)揮重要作用。KCNQ2/KCNQ3通道的突變已經被證實是良性家族性新生兒驚厥(benign familial neonatal epilepsy, BFNC)的分子發(fā)病基礎,KCNQ通道的激活可以減少或降低未成熟大腦的神經元興奮性的發(fā)放和傳遞。多種因素如神經遞質、激素及細胞外離子等通過不同的途徑調節(jié)KCNQ通道產生的M電流,從而對神經元興奮性的調節(jié)、神經遞質的釋放和突觸的傳遞等產生影響。因此,研究KCNQ2鉀離子通道的調節(jié)機制,對了解多種疾病的發(fā)病機理和發(fā)現(xiàn)新的治療途徑均具有重要的意義。溫度對于KCNQ2離子通道的作用尚不清楚,本研究的目的是檢測溫度對KCNQ2通道的影響,并探討KCNQ2通道特異性的激活劑氟吡汀對反復熱性驚厥(repetitive febrile seizure, RFS)大鼠模型的治療作用。 方法： 1)采用PCR方法擴增目的基因,構建攜帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標簽的野生型pEGFP-C1-KCNQ2。在融合表達載體構建成功的基礎上,在通道上的這兩個區(qū)域選擇了與BFNC相關的位點進行了定點突變。第一個選擇的位點S4區(qū)段電壓敏感區(qū)第214位精氨酸突變?yōu)樯彼?R214W, R→W),第二個位點位于p-loop區(qū)段第284位酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼?Y284C, Y→C)。最后利用重疊延伸(overlap extension) PCR的方法構建R214W、Y284C突變型和孔區(qū)截短突變型真核表達載體； 2)用構建成功的野生型和突變型KCNQ2的真核表達載體并分別轉染小鼠神經瘤細胞(mouse neuroblastoma cells, N2a)和人胚腎293T細胞(human embryonic kindey, HEK293T cell),熒光共聚焦顯微鏡(confocal)和Western-blotting檢測野生及突變型KCNQ2蛋白在不同溫度下的表達情況；將內質網(wǎng)定位質粒pDsRed-ER質粒和野生及突變型KCNQ2的真核表達載體共轉染后,Confocal觀察野生及突變型KCNQ2蛋白在細胞內的分布及定位情況； 3)全細胞膜片鉗記錄不同溫度下HEK293T細胞上的野生及突變型KCNQ2鉀通道的電生理特性； 4)對SPF級10日齡雄性SD大鼠采用45℃熱水浴方法制備反復熱性驚厥模型,并給以氟吡汀或者苯巴比妥治療,觀察各組大鼠熱性驚厥的發(fā)作情況。大鼠28日齡時再次誘發(fā)熱性驚厥,觀察不同組大鼠再次驚厥發(fā)作的易感性變化。大鼠30日齡時通過水迷宮方法觀察大鼠學習記憶能力的變化。 結果： 1)經DNA測序分析證實野生及突變型重組載體構建正確。全細胞膜片鉗結果提示野生型pEGFP-C1-KCNQ2表達的電流呈外向、電壓依賴性、慢激活特征,達最大穩(wěn)態(tài)電流后表現(xiàn)非失活特征； 2)溫度從37℃升高到40℃后,熒光顯微鏡結果顯示轉染野生KCNQ2及突變型R214W和Y284C的細胞熒光強度明顯增強(p0.001),同時共定位結果分析提示野生及突變型KCNQ2通道蛋白在細胞內滯留,但是孔區(qū)截短型通道的表達在溫度升高后沒有增加；Western-blotting結果表明溫度升高后,野生型和突變型KCNQ2通道總蛋白的表達都顯著增加(p0.05),但是膜表面表達沒有明顯變化； 3)電生理結果表明溫度升高可導致KCNQ2通道的激活曲線明顯左移,提示高溫情況下KCNQ2通道電壓依賴性激活的閾值顯著性降低； 4)氟吡汀和苯巴比妥這兩種藥物都能顯著地延長熱性驚厥的潛伏期、降低驚厥的發(fā)作等級,并使再次驚厥的易感性下降。水迷宮實驗結果表明氟吡汀組在學習和記憶方面損傷較非藥物處理組小。 結論：溫度升高增加了KCNQ2通道在細胞內的表達并且降低了KCNQ2通道的激活閾值,孔區(qū)可能是KCNQ2通道轉運過程中的重要影響因素。同時,氟吡汀可治療反復熱性驚厥的發(fā)作,KCNQ通道作為治療兒童反復熱性驚厥的新靶點值得進一步研究。
[Abstract]:Objective: the voltage dependent potassium channel (KCNQ2 Kv7.2) play in the regulation of neuronal excitability mutations in the important role of.KCNQ2/KCNQ3 channels has been proved to be benign familial neonatal convulsions (benign familial neonatal epilepsy, BFNC) molecular pathogenesis, activation can reduce or reduce the immature brain excitatory neurons release and transfer KCNQ channel. Many factors such as hormones and neurotransmitters, M current extracellular ions produced by different pathways that regulate KCNQ channels, so as to regulate the excitability of neurons, influence transmission of neurotransmitter release and synaptic. Therefore, the mechanism of regulation of KCNQ2 potassium channel, new therapeutic approaches are important to understand the pathogenesis of many diseases and found. The temperature for KCNQ2 ion channel function is not clear, the purpose of this study is to Effect of temperature on the detection of KCNQ2 channel, KCNQ2 channel and explore specific activator of flupirtine on recurrent febrile seizures (repetitive febrile, seizure, RFS) rats model.
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