本文關(guān)鍵詞：腺相關(guān)病毒介導(dǎo)IL-10轉(zhuǎn)基因治療對(duì)兔自身免疫淚腺炎干眼模型免疫抑制作用　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 淚腺功能異常是干眼的主要原因,而自身免疫淚腺炎如Sjogren's綜合癥是淚液分泌不足的常見(jiàn)原因。本研究的目的是探討兔淚腺上皮細(xì)胞激活自體外周血淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)兔自身免疫干眼模型,并對(duì)臨床體征和組織病理變化進(jìn)行評(píng)估;采用四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)(Tet系統(tǒng))調(diào)控的AAV載體介導(dǎo)IL-10轉(zhuǎn)基因治療,觀察IL-10在淚腺和眼表的表達(dá)時(shí)間及變化,評(píng)估IL-10對(duì)淚腺免疫病理和眼表體征的作用。 方法： 1.結(jié)合濾膜分離和密度梯度離心法分離提純兔淚腺上皮細(xì)胞(pLGEC),對(duì)分離細(xì)胞的活性、純度、形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。分離的pLGEC體外培養(yǎng)2d后gamma射線照射,與等量(105細(xì)胞/孔,96孔板)自體外周血淋巴細(xì)胞(PBL)混合培養(yǎng)5d. [3H]-thymidine摻入法鑒定PBL增殖率。對(duì)培養(yǎng)前及培養(yǎng)后PBL行細(xì)胞表面抗T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD4和CD8單克隆抗體染色和FACS分析。 2.新西蘭白兔左眼下淚腺切除,分離淚腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)2d,gamma線照射,與體外獨(dú)立培養(yǎng)2d的自體PBL混合培養(yǎng)5d,[3H]-thymidine摻入法測(cè)定PBL激活情況。自平行培養(yǎng)的混合細(xì)胞內(nèi)分離激活的PBL,用于自體過(guò)繼轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型制備。[3H]-thymidine摻入實(shí)驗(yàn)測(cè)定激活指數(shù)大于2者將分離的PBL經(jīng)耳靜脈注射回供體兔誘發(fā)自身免疫干眼病(ID/IV).致病組一組注射后4周處死(ID/IV4, n=9),另一組注射后8周處死(ID/IV8, n=6).陰性對(duì)照組(n=8)摘除左眼下淚腺,耳靜脈注射未經(jīng)混合培養(yǎng)的自體外周血淋巴細(xì)胞(未激活)。未經(jīng)任何處理的正常兔作為正常對(duì)照組(n=4)。注射前及注射后每2周雙眼眼表臨床檢查,包括SchirmerⅠ實(shí)驗(yàn)、BUT和rose Bengal染色。處死后收集兔上、下淚腺,結(jié)膜和唾液腺進(jìn)行組織病理HE染色和免疫組化染色。 3.與淚腺上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)激活的自體外周血淋巴細(xì)胞注射回供體兔誘發(fā)自身免疫性淚腺炎(n=16)。注射后4周,一組下淚腺注射AAV2-tetON-vIL-10(1x 108pfu/200 L)轉(zhuǎn)基因治療(ID/Rx, n=8);未注射組作為對(duì)照組(ID,n=8),兩組兔每日飲用水內(nèi)均加入強(qiáng)力霉素(200mg/kg),誘導(dǎo)vIL-10表達(dá)。致病后16周(轉(zhuǎn)基因治療后12周)處死兔取淚腺進(jìn)行病理和免疫組化分析。 結(jié)果： 1.光學(xué)顯微鏡鏡檢顯示分離的細(xì)胞主要為直徑為16 um的單個(gè)腺泡細(xì)胞或3-20個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán),培養(yǎng)4天時(shí)細(xì)胞聚集成腺泡樣細(xì)胞團(tuán)。PBL-pLGEC混合細(xì)胞培養(yǎng)組[3H]一thymidine摻入增殖指數(shù)是單獨(dú)PBL組或照射后pLGEC組的5-8倍；FACS分析顯示與未激活的單獨(dú)培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞群相比,被自體淚腺上皮細(xì)胞激活后的外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞數(shù)含量增加了約2倍。在激活前外周血CD4+T細(xì)胞占T細(xì)胞的20%,而激活后增高到70%。CD8+T細(xì)胞在激活反應(yīng)前及激活反應(yīng)后含量無(wú)明顯改變。B細(xì)胞的含量在激活前后也保持不變或減少。 2.與正常組相比,靜脈注射致病后4周淚液分泌減少50%,淚膜破裂時(shí)間縮短70%。Rose Bengal染色顯示眼表上皮缺損,但與直接淚腺注射致病組比較程度減輕。靜脈注射后4周淚腺內(nèi)腺管周圍和小血管周圍頻繁可見(jiàn)以CD+T細(xì)胞為主的大的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶；同時(shí)可見(jiàn)淋巴流動(dòng)樣浸潤(rùn)區(qū)。注射后8周淚腺病理改變較4周加重,顎下腺腺葉內(nèi)也可見(jiàn)大面積的腺泡變性區(qū)和淋巴流動(dòng)樣浸潤(rùn)灶。 3.ID,/Rx組臨床體征較ID組總體明顯改善。組織病理檢查顯示ID組可見(jiàn)散在大的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)灶和腺泡變性或萎縮,而ID/Rx組淋巴浸潤(rùn)灶減少、變小。與ID組相比,ID/Rx組淚腺內(nèi)CD18+細(xì)胞增加5倍之多,CD4：CD8比率減少16倍,而RTLA.細(xì)胞數(shù)兩組間無(wú)差異。 結(jié)論： 1.結(jié)合濾膜分離和密度梯度離心法可獲得較高純度的淚腺上皮細(xì)胞,培養(yǎng)、照射后可成功激活自體外周血淋巴細(xì)胞。 2.被淚腺抗原激活的淋巴細(xì)胞經(jīng)耳靜脈注射回供體兔可歸巢到淚腺和顎下腺并促發(fā)自身免疫過(guò)程,說(shuō)明這些部位本質(zhì)上包含抗原提呈細(xì)胞,這些細(xì)胞表達(dá)致病性自身抗原表位；同時(shí)還含有招募CD4-T細(xì)胞的化學(xué)因子和淋巴細(xì)胞歸巢分子。這種經(jīng)耳靜脈途徑制備的兔干眼模型,由于顎下腺和淚腺同時(shí)受累,更逼真的模擬了Sjogren's綜合征。該模型更適用于闡明Sjogren's發(fā)病機(jī)理和病理生理的研究,同時(shí)也是評(píng)估治療方法的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?3.AAV介導(dǎo)的vIL-10轉(zhuǎn)基因治療可改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫淚腺炎的臨床體征和病理變化。通過(guò)免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)vIL-10治療不僅僅是通過(guò)免疫抑制機(jī)制,而更可能是通過(guò)提高CD8-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)受體細(xì)胞介導(dǎo)的免疫調(diào)解反應(yīng)的產(chǎn)生。
[Abstract]:Purpose:
The lacrimal gland dysfunction is primary cause of dry eye, and autoimmune dacryoadenitis such as Sjogren's syndrome is a common cause of insufficient tear secretion. The purpose of this study is to investigate the rabbit lacrimal gland epithelial cells to activate autologous peripheral blood lymphocytes, immune induced rabbit dry eye model, and to evaluate the clinical signs and pathological changes of tissues by tetracycline; the regulation of gene expression system (Tet system) AAV mediated regulation of IL-10 mediated gene therapy, observe the expression of IL-10 in lacrimal gland and time of ocular surface and change, evaluate the effects of IL-10 on the lacrimal gland immune pathology and signs of ocular surface.
Method錛，

本文編號(hào)：1369957