本文關鍵詞：帶有Tuftsin的分支狀流感病毒M2e多肽疫苗的研究　出處：《中國疾病預防控制中心》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：甲型流感病毒因其基因變異頻繁、傳播速度快、人群普遍易感、控制難度大等原因易發(fā)生世界范圍的大流行,嚴重危害人類健康并影響社會經(jīng)濟發(fā)展。目前預防流感的主要措施仍是接種疫苗。目前應用的流感疫苗都是針對流感病毒膜蛋白HA和NA,通過誘導機體產(chǎn)生中和抗體發(fā)揮保護作用。但HA和NA頻繁發(fā)生變異,每年都需要根據(jù)流行株的情況決定制備疫苗所用的毒株。因此,研發(fā)對不同亞型的甲型流感病毒株有交叉保護作用的通用疫苗是當前的研究熱點之一。 M2蛋白是流感病毒表面的一種膜蛋白,由97個氨基酸組成。M2蛋白胞外區(qū)(M2e)的氨基酸序列高度保守,并且其抗血清有抑制流感病毒復制的功能,因而成為“通用流感疫苗”的重要候選抗原。但M2e僅含23個氨基酸,分子量小、免疫原性較差。分支狀多抗原肽系統(tǒng)是利用賴氨酸(Lys)的兩個氨基分別能與另一個氨基酸的羧基形成肽鍵這一特征,以數(shù)個Lys (n)作為核心,通過化學合成方法制備的大分子分支狀多肽,可以使多肽分子的穩(wěn)定性和免疫原性大大提高。 在分支狀多肽分子的羧基端加上一段具有免疫活性的短肽,可以增強其免疫效果。Tuftsin就是這樣一種免疫活性肽。它是IgG分子Fc段中的一個四肽片段。多種參與抗原呈遞的細胞表面都有其受體,它自身的免疫原性極弱但能增強機體對與其連接的抗原肽的免疫反應。 本研究旨在結(jié)合并充分發(fā)揮分支狀多抗原肽技術和Tuftsin的優(yōu)勢,研制針對流感病毒M2e蛋白的具有交叉保護效果的通用流感疫苗。本研究共包括以下四方面工作： 1.分支狀多肽的理化性質(zhì)及生物學活性鑒定 我們應用化學合成法得到分支狀(M2e)4-Tuftsin的純品,作為對照,我們又合成了用四個甘氨酸取代Tuftsin的分支狀(M2e)4-G4以及單體M2e。得到純品后,我們首先通過反相高效液相法檢測合成肽的純度,結(jié)果三種合成肽的純度分別達到93-99%,可用于后續(xù)實驗。用質(zhì)譜法檢測三種合成肽的分子量,M2e單體的理論值為2624.87,測得值為2625.77; (M2e)4-Tuftsin的理論值為11312.53,測得值為11558.00；(M2e)4-G4的理論值為11058.15測得值為11114.00,實測結(jié)果均與理論值相近似。表明合成的多肽與我們的設計相符。 應用SDS-PAGE進一步檢測了分支狀多肽的純度與分子量,考馬斯蘭染色可在11kDa處看到明顯條帶,表明分支肽的分子量與理論值相似,說明其結(jié)構(gòu)完整并與設計一致。用抗M2單克隆抗體做Western blot,結(jié)果顯示上述條帶可被抗M2抗體識別。將上述三種合成肽分別包被96孔板,ELISA檢測結(jié)果表明三種多肽均能與抗M2單克隆抗體特異性結(jié)合。以上結(jié)果說明三種合成肽均具有甲型流感病毒M2蛋白的抗原性。 我們進而通過巨噬細胞結(jié)合實驗檢測與分支狀多肽連接的Tuftsin能否促進其與巨噬細胞的結(jié)合。用熒光素FITC分別標記帶有Tuftsin的分支肽(M2e)4-Tuftsin和對照肽(M2e)4-G4,然后將二者分別與小鼠腹腔巨噬細胞在4℃共同孵育。用1640培養(yǎng)液洗細胞兩次后,在熒光顯微鏡下觀察它們與巨噬細胞結(jié)合情況。FITC-(M2e)4-Tuftsin與小鼠腹腔巨噬細胞孵育后可見細胞表面有綠色熒光,說明前者能夠與細胞表面的受體結(jié)合；而FITC-(M2e)4-G4孵育的細胞未見綠色熒光,說明對照分支肽不能與巨噬細胞結(jié)合。這一結(jié)果證實分支肽能借助Tuftsin與巨噬細胞表面的受體結(jié)合,有助于其被抗原呈遞細胞處理。 2.分支狀多肽疫苗肌肉注射免疫效果的研究 本研究進行了分支肽刺激體內(nèi)免疫反應的研究。將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為四組：PBS組、M2e單體組、(M2e)4-Tuftsin組和(M2e)4-G4組。將PBS和三種合成肽分別與等體積氫氧化鋁佐劑混合,肌肉注射接種小鼠。注射的合成肽總量為10μg/只。各組小鼠均免疫接種兩次,每次免疫間隔兩周。于每次免疫前1天和末次免疫后兩周分別從小鼠眼眶后靜脈采血,收集血清用于抗體檢測。末次免疫后兩周,用10×LD50流感病毒鼠肺適應株PR8株病毒攻擊小鼠,每日觀察各組小鼠的存活情況及體重變化,評價各種多肽的免疫保護效果。 (1)體液免疫水平評價用合成的M2e單體包被96孔ELISA板,采用間接ELISA方法檢測不同免疫組小鼠免疫后血清中抗M2e IgG抗體效價。結(jié)果顯示兩次免疫后M2e單體組誘導的抗體滴度為10,而(M2e)4-Tuftsin和(M2e)4-G4組誘導產(chǎn)生的抗M2e抗體滴度分別為89144和29407,均顯著比M2e單體組高,說明這兩種分支狀多肽都能誘導小鼠產(chǎn)生高水平抗M2e抗體,而其中(M2e)4-Tuftsin組誘導產(chǎn)生的抗體水平最高,說明與四分支M2e連接的Tuftsin確實有免疫增強作用。 (2)細胞免疫水平評價采用ELISPOT方法檢測免疫后小鼠脾細胞中特異性產(chǎn)生γ干擾素的細胞數(shù),間接反映Thl細胞的特異性反應功能。于末次免疫后第12天,取小鼠脾臟分離淋巴細胞。ELISPOT試驗按照BD公司ELISPOT試劑盒說明書操作,用合成的M2e單體刺激各組小鼠脾細胞。結(jié)果顯示,在M2e刺激下,PBS組平均每1×106細胞產(chǎn)生6個斑點,M2e單體組產(chǎn)生46個斑點,(M2e)4-Tuftsin組產(chǎn)生254個斑點,(M2e)4-G4組產(chǎn)生156個斑點,說明三種合成肽均能誘導小鼠產(chǎn)生針對M2e的特異性細胞免疫,其中分支肽免疫組明顯高于M2e單體組,而(M2e)4-Tuftsin組誘導細胞免疫的能力最強。 (3)保護性評價流感病毒攻擊實驗結(jié)果顯示,至攻毒后14天,PBS組存活率為10%,M2e單體組存活率為30%,分支狀(M2e)4-G4組存活率為44%,而接種分支狀(M2e)4-Tuftsin組小鼠的存活率達到80%。說明兩種分支狀多肽均能在一定程度上緩解小鼠由于病毒感染引發(fā)的癥狀,并顯著降低小鼠死亡率。與體液免疫和細胞免疫結(jié)果相一致,其中(M2e)4-Tuftsin的免疫保護效果最好。 3.分支狀多肽疫苗滴鼻接種免疫效果的研究 由于流感病毒是通過呼吸道感染,呼吸道的粘膜免疫會有重要的保護作用。肌肉注射免疫主要刺激產(chǎn)生血清抗體,不產(chǎn)生分泌型IgA。故而我們嘗試通過鼻腔粘膜進行免疫。由于單獨用合成肽免疫的效果不好,所以需要加上合適的佐劑。JY佐劑是將帶有正電荷的殼聚糖與帶有負電荷的具有免疫調(diào)節(jié)活性的白細胞介素-2(IL-2)所組成的復方。我們將JY佐劑與合成的幾種多肽分別混合,滴鼻接種小鼠,觀察其粘膜免疫效果。 將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為四組：PBS組、M2e單體組、(M2e)4-Tuftsin組和(M2e)4-G4組。將PBS和三種合成肽分別與等體積2×JY佐劑混合。先用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠,待小鼠明顯無力后,向小鼠鼻腔滴加10u 1候選疫苗(或PBS),接種多肽總量為10μg/只。各組小鼠均免疫三次,每次免疫間隔兩周。于每次免疫前1天和末次免疫后兩周分別從小鼠眼眶后靜脈采血,用于血清抗體檢測。末次免疫后兩周,用10×LD50的PR8株流感病毒攻擊小鼠,每日觀察各組小鼠的存活情況及體重變化,以評價各組的粘膜免疫保護效果。 (1)體液免疫水平評價用合成的M2e單體包被96孔ELISA板,采用間接ELISA方法檢測不同免疫組小鼠免疫后血清中抗M2e IgG抗體效價。ELISA檢測結(jié)果顯示,末次免疫后兩周M2e單體、(M2e)4-Tuftsin和(M2e)4-G4誘導產(chǎn)生的抗M2e抗體滴度分別為8、4526和3592,兩種分支狀多肽誘導小鼠產(chǎn)生的抗體滴度均明顯高于M2e單體,其中分支狀(M2e)4-Tuftsin誘導產(chǎn)生的抗體水平最高,與肌肉注射途徑免疫的結(jié)果一致。但滴鼻免疫小鼠的血清IgG抗體滴度遠低于肌肉注射途徑誘導的抗體滴度,分析原因可能是由于鼻腔免疫的作用機理與肌肉注射不同,它主要是誘導局部粘膜免疫而不是全身的體液免疫。 (2)細胞免疫水平評價采用ELISPOT方法檢測免疫后小鼠脾細胞中特異性產(chǎn)生γ干擾素的細胞數(shù),間接反映Thl細胞的特異性反應功能。于末次免疫后第12天,取小鼠脾臟分離淋巴細胞。ELISPOT試驗按照BD公司ELISPOT試劑盒說明書操作,用合成的M2e單體刺激各組小鼠脾細胞。ELISPOT結(jié)果顯示,在M2e單體刺激下,PBS組平均每1×106細胞產(chǎn)生22個斑點,M2e單體產(chǎn)生49個斑點,分支肽(M2e)4-Tuftsin組產(chǎn)生371個斑點,對照分支肽(M2e)4-G4組產(chǎn)生112個斑點,說明分支狀M2e鼻腔免疫后誘導小鼠產(chǎn)生的細胞免疫水平顯著高于M2e單體組,而(M2e)4-Tuftsin誘導細胞免疫的能力最強。 (3)保護性評價流感病毒攻擊小鼠14天后PBS組小鼠全部死亡,而M2e單體組、(M2e)4-Tuftsin組和(M2e)4-G4組存活率均為40%,說明三種多肽鼻腔免疫均有一定免疫保護作用,但保護效果較肌肉注射途徑弱。 上述結(jié)果證實,分支狀多肽技術大大增強了短肽抗原的免疫原性,而帶有Tuftsin的分支狀多肽免疫效果最好,是一種值得開發(fā)和推廣的新型疫苗制備技術。 4.可調(diào)控表達甲型流感病毒M2蛋白的哺乳動物細胞系的建立與鑒定 鑒于M2蛋白表達系統(tǒng)在研發(fā)與M2蛋白相關的流感通用疫苗中的重要作用,本研究構(gòu)建了可調(diào)控表達M2蛋白的哺乳動物細胞系。首先應用PCR方法從含有流感病毒PR8株第七節(jié)段全長基因的質(zhì)粒中擴增得到M2基因。將該片段亞克隆到真核表達載體pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定正確后將重組質(zhì)粒與表達Flp重組酶的pOG44質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Flp-In T-REx-293細胞,使目的基因整合到宿主細胞染色體。篩選具有Hygromycin B抗性的細胞株。在該細胞的培養(yǎng)基中加入四環(huán)素以誘導目的基因表達,48 h后通過間接免疫熒光方法檢測到M2蛋白的表達。共得到16株高表達M2蛋白的重組細胞株,這些細胞株在傳十代后仍能穩(wěn)定表達目的蛋白。未加四環(huán)素誘導的細胞沒有檢測到M2蛋白,說明四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)嚴格控制著目的基因的表達。今后,該細胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候選疫苗的免疫學評價以及流感病毒減毒活疫苗的研制。綜上所述,本研究結(jié)果表明分支狀多肽比單體短肽的免疫原性大大增強,而帶有免疫活性肽Tuftsin的分支肽刺激免疫反應的效果最好。本文提供了一種非常有希望的新型疫苗制備技術,為進一步研發(fā)基于M2蛋白的廣譜流感疫苗奠定了基礎。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 鄭麗舒;段招軍;;A型流感病毒M2蛋白疫苗的研究進展[J];病毒學報;2006年06期

2 杜寧;楊霄星;藍雨;溫樂英;李曉丹;高榮保;郭元吉;李德新;舒躍龍;;1968年香港流感(H3N2)病原學概述[J];病毒學報;2009年S1期

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本文編號：1359063