本文關鍵詞：NOD2上調HAECs Ⅰ類干擾素表達和TLR3誘導HUVECs凋亡的研究　出處：《中南大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第1章NOD2上調人主動脈內皮細胞Ⅰ類干擾素基因的表達 研究背景：胞壁二肽(MDP)是一種病原體相關分子模式(PAMPs), MDP可以被胞漿核酸結合寡核苷酸域-2(NOD2)識別。NLRs是在動物體內新發(fā)現的固有免疫分子,最先報道的通過對PAMPs刺激起反應而發(fā)揮微生物分子識別功能的NLRs就是NOD1(CARD4)和NOD2(CARD15), NLRs可影響動脈粥樣硬化進程。有報道稱Ⅰ類干擾素家族與人類動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關。MDP能直接誘導細胞因子,包括干擾素的產生,激活并調節(jié)免疫和炎癥反應。我們發(fā)現MDP能誘導HAECs表達Ⅰ類干擾素,但其機制尚不清楚。 目的：觀察MDP對HAECs Ⅰ類干擾素表達的影響,探討MDP通過NOD2上調HAECs Ⅰ類干擾素基因的表達的機制,討論MDP對HAECs其它炎癥因子表達的影響。 方法：按實驗要求用MDP處理HAECs,用RT-PCR、qRT-PCR測定HAECs IFN-α, IFN-β, IL-1β, IL-8和MCP-1基因的表達。用RT-PCR技術測定與MDP誘導HAECs I類干擾素表達相關的基因NOD1,NOD2, TNF-α, IRFs表達,用Western-blot技術進一步研究其機制。 結果： 1.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時,測定IFN-α與IFN-β基因的表達,發(fā)現MDP呈劑量依賴的上調Ⅰ類干擾素的表達。 2.用10μg/ml的MDP處理HAECs不同時間(0、1、3、6、12、24h),測定IFN-α與IFN-β基因的表達,發(fā)現MDP呈時間依賴的上調I類干擾素的表達。 3.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時,測定NOD2基因的表達,可使NOD2基因表達上調。 4.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時,測定NOD1基因的表達,可使NOD1基因表達下調。 5.用不同濃度(0、1、5、10、50、100ng/ml)的TNFα處理HAECs24小時,測定IFNα和IFNβ基因的表達,發(fā)現TNFα呈劑量依賴的上調IFNα和IFNP基因的表達。 6.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時,用RT-PCR測定TNFa基因的表達,發(fā)現基本無TNFa基因表達。 7.用不同濃度(0,0,2,10,0,10μg/ml)的TNFa中和抗體預處理HAECs30分鐘,再用0,10μg/ml MDP及0,5ng/ml TNFa干預24小時,用qRT-PCR測定IFNs的表達,結果發(fā)現TNFα中和抗體不能降低MDP誘導的I類干擾素表達。 8.用RT-PCR檢測HAECs IRFs基因的表達,發(fā)現HAECs表達IRF1,2,3,9,但是基本上不表達IRF4,5,6,7,8。 9.用10μg/ml MDP處理HAECs不同時間(0、5、10、30、60、120min),發(fā)現MDP在5分鐘、10分鐘及30分鐘時誘導了IRF3的磷酸化。半定量分析結果顯示與對照組相比較磷酸化的IRF3顯著增加發(fā)生在5分鐘、10分鐘、30分鐘和60分鐘。 10.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時,測定炎癥因子基因的表達,發(fā)現MDP呈劑量依賴性的上調炎癥因子包括：IL-1β, IL-8和MCP-1的表達。 結論：MDP可以通過IRF3途徑上調HAECs I類干擾素基因的表達,MDP呈劑量依賴性的上調炎癥因子包括：IL-1β, IL-8和MCP-1的表達。。 研究背景：動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,已知多種TLRs如TLR1、TLR2、TLR4、TLR9等與動脈粥樣硬化關系密切。TLR3是TLRs家族的第一個成員,其作為一種模式識別受體(pathogen recognition receptors, PRRs),被認為用來識別一種保守的病毒分子形態(tài)即雙鏈RNA, TLR3在多種細胞廣泛表達,但是尚未有報道認為其與動脈粥樣硬化存在相關性。TLR3可介導多種腫瘤細胞凋亡,我們發(fā)現TLR3還可以通過內源性和外源性的凋亡途徑介導血管內皮細胞凋亡從而損傷內皮功能。 目的：研究人工合成的dsRNA類似物Poly (I-C)對HUVECs生物學功能的影響,探討固有免疫系統(tǒng)中PRRs在Poly (I-C)誘導的HUVECs凋亡過程中的作用及其機制。 方法：按要求用poly(I-C)處理原代的或者永生化HUVECs,用流式細胞儀分析HUVECs的凋亡情況,用RT-PCR、qRT-PCR及流式細胞技術檢測TLR3及一些炎癥因子的表達。進一步用Western blot、 ELISA、RT-PCR、RNA干擾等技術觀察poly(I-C)對內源性及外源性凋亡途徑中相關細胞因子的表達的影響。 結果： 1.流式細胞技術發(fā)現用poly(I-C)干預HUVECs24小時,可見早期凋亡、晚期凋亡逐漸增多,TLR3中和抗體和siRNA轉導能顯著抑制poly(I-C)誘導的細胞凋亡,p63下調抑制poly(I-C)誘導的HUVECs細胞凋亡。 2. RT-PCR還顯示HUVECs表達低水平的TRAIL, DR4和DR5,poly(I-C)呈劑量依賴方式上調TRAIL及其受體(DR4和DR5)的表達,呈劑量依賴的下調Bcl-2基因的表達,上調BH3基因表達,上調TAp63a基因表達,p63RNA干擾抑制HUVECs TRAIL,DR4,和DR5的表達。 3. West-blot技術發(fā)現poly(I-C)上調HUVECs TLR3蛋白的表達,在5-10μg/ml poly(I-C)干預的細胞時其TLR3蛋白表達水平較低,poly(I-C)下調Bcl-2蛋白的表達,上調BH3蛋白表達,上調TAp63a的表達,TLR3shRNA下調TLR3并抑制HUVECs TAp63a的表達,顯著抑制Bcl-2的下調和Noxa的上調,P63RNA干擾下調HUVECs Bcl-2的表達,上調Noxa的表達,抑制HUVECs caspases8、9和PARP的激活。 4.實時定量RT-PCR數據顯示：poly(I-C)能顯著上調HUVECs的TLR3基因表達。 5. ELISA結果顯示poly(I-C)顯著上調HUVECs TRAIL表達。 結論：poly(I-C)可誘導HUVECs凋亡,TLR3通過上調TAP63a激活死亡受體及線粒體途徑誘導HUVECs細胞凋亡,損傷內皮功能。
[Abstract]:The first chapter NOD2 expression in human aortic endothelial cells of type I interferon gene
Background: cell wall peptide two (MDP) is a kind of pathogen associated molecular patterns (PAMPs), MDP can be cytoplasmic nucleic acid binding domain -2 oligonucleotide (NOD2) identification of.NLRs is the innate immune molecules found in the animal body, first reported by stimulation of PAMPs by reacting function microbial molecular recognition NLRs is NOD1 (CARD4) and NOD2 (CARD15), NLRs can affect the process of atherosclerosis has been reported. Type I interferon family and human atherosclerotic plaque instability on.MDP can directly induce cytokines, including interferon production, activation and regulation of immune and inflammatory reaction. We found that MDP could induce HAECs expression of type I interferon. But the mechanism is not clear.
Objective: To observe the effect of MDP on the expression of HAECs class I interferon, and to explore the mechanism of MDP up regulating the expression of HAECs class I interferon gene through NOD2, and to discuss the effect of MDP on the expression of other inflammatory factors in HAECs.
Methods: according to the requirements of experiments using MDP HAECs, RT-PCR, qRT-PCR by HAECs IFN- alpha, IFN- beta, beta IL-1, IL-8 and MCP-1 gene expression induced by MDP and HAECs. The determination of type I interferon gene expression NOD1, associated with the technology of RT-PCR NOD2, TNF- alpha, IRFs expression, using Western-blot Technology to further study the mechanism of.
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本文編號：1359100