本文關(guān)鍵詞：NOD2上調(diào)HAECs Ⅰ類干擾素表達(dá)和TLR3誘導(dǎo)HUVECs凋亡的研究　出處：《中南大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第1章NOD2上調(diào)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Ⅰ類干擾素基因的表達(dá) 研究背景：胞壁二肽(MDP)是一種病原體相關(guān)分子模式(PAMPs), MDP可以被胞漿核酸結(jié)合寡核苷酸域-2(NOD2)識別。NLRs是在動(dòng)物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的固有免疫分子,最先報(bào)道的通過對PAMPs刺激起反應(yīng)而發(fā)揮微生物分子識別功能的NLRs就是NOD1(CARD4)和NOD2(CARD15), NLRs可影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。有報(bào)道稱Ⅰ類干擾素家族與人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)。MDP能直接誘導(dǎo)細(xì)胞因子,包括干擾素的產(chǎn)生,激活并調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)MDP能誘導(dǎo)HAECs表達(dá)Ⅰ類干擾素,但其機(jī)制尚不清楚。 目的：觀察MDP對HAECs Ⅰ類干擾素表達(dá)的影響,探討MDP通過NOD2上調(diào)HAECs Ⅰ類干擾素基因的表達(dá)的機(jī)制,討論MDP對HAECs其它炎癥因子表達(dá)的影響。 方法：按實(shí)驗(yàn)要求用MDP處理HAECs,用RT-PCR、qRT-PCR測定HAECs IFN-α, IFN-β, IL-1β, IL-8和MCP-1基因的表達(dá)。用RT-PCR技術(shù)測定與MDP誘導(dǎo)HAECs I類干擾素表達(dá)相關(guān)的基因NOD1,NOD2, TNF-α, IRFs表達(dá),用Western-blot技術(shù)進(jìn)一步研究其機(jī)制。 結(jié)果： 1.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時(shí),測定IFN-α與IFN-β基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MDP呈劑量依賴的上調(diào)Ⅰ類干擾素的表達(dá)。 2.用10μg/ml的MDP處理HAECs不同時(shí)間(0、1、3、6、12、24h),測定IFN-α與IFN-β基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MDP呈時(shí)間依賴的上調(diào)I類干擾素的表達(dá)。 3.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時(shí),測定NOD2基因的表達(dá),可使NOD2基因表達(dá)上調(diào)。 4.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時(shí),測定NOD1基因的表達(dá),可使NOD1基因表達(dá)下調(diào)。 5.用不同濃度(0、1、5、10、50、100ng/ml)的TNFα處理HAECs24小時(shí),測定IFNα和IFNβ基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TNFα呈劑量依賴的上調(diào)IFNα和IFNP基因的表達(dá)。 6.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時(shí),用RT-PCR測定TNFa基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)基本無TNFa基因表達(dá)。 7.用不同濃度(0,0,2,10,0,10μg/ml)的TNFa中和抗體預(yù)處理HAECs30分鐘,再用0,10μg/ml MDP及0,5ng/ml TNFa干預(yù)24小時(shí),用qRT-PCR測定IFNs的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNFα中和抗體不能降低MDP誘導(dǎo)的I類干擾素表達(dá)。 8.用RT-PCR檢測HAECs IRFs基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HAECs表達(dá)IRF1,2,3,9,但是基本上不表達(dá)IRF4,5,6,7,8。 9.用10μg/ml MDP處理HAECs不同時(shí)間(0、5、10、30、60、120min),發(fā)現(xiàn)MDP在5分鐘、10分鐘及30分鐘時(shí)誘導(dǎo)了IRF3的磷酸化。半定量分析結(jié)果顯示與對照組相比較磷酸化的IRF3顯著增加發(fā)生在5分鐘、10分鐘、30分鐘和60分鐘。 10.用不同濃度(0、0.1、0.5、1、5、10μg/ml)的MDP處理HAECs24小時(shí),測定炎癥因子基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)MDP呈劑量依賴性的上調(diào)炎癥因子包括：IL-1β, IL-8和MCP-1的表達(dá)。 結(jié)論：MDP可以通過IRF3途徑上調(diào)HAECs I類干擾素基因的表達(dá),MDP呈劑量依賴性的上調(diào)炎癥因子包括：IL-1β, IL-8和MCP-1的表達(dá)。。 研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,已知多種TLRs如TLR1、TLR2、TLR4、TLR9等與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切。TLR3是TLRs家族的第一個(gè)成員,其作為一種模式識別受體(pathogen recognition receptors, PRRs),被認(rèn)為用來識別一種保守的病毒分子形態(tài)即雙鏈RNA, TLR3在多種細(xì)胞廣泛表達(dá),但是尚未有報(bào)道認(rèn)為其與動(dòng)脈粥樣硬化存在相關(guān)性。TLR3可介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,我們發(fā)現(xiàn)TLR3還可以通過內(nèi)源性和外源性的凋亡途徑介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而損傷內(nèi)皮功能。 目的：研究人工合成的dsRNA類似物Poly (I-C)對HUVECs生物學(xué)功能的影響,探討固有免疫系統(tǒng)中PRRs在Poly (I-C)誘導(dǎo)的HUVECs凋亡過程中的作用及其機(jī)制。 方法：按要求用poly(I-C)處理原代的或者永生化HUVECs,用流式細(xì)胞儀分析HUVECs的凋亡情況,用RT-PCR、qRT-PCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測TLR3及一些炎癥因子的表達(dá)。進(jìn)一步用Western blot、 ELISA、RT-PCR、RNA干擾等技術(shù)觀察poly(I-C)對內(nèi)源性及外源性凋亡途徑中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)用poly(I-C)干預(yù)HUVECs24小時(shí),可見早期凋亡、晚期凋亡逐漸增多,TLR3中和抗體和siRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)能顯著抑制poly(I-C)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,p63下調(diào)抑制poly(I-C)誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡。 2. RT-PCR還顯示HUVECs表達(dá)低水平的TRAIL, DR4和DR5,poly(I-C)呈劑量依賴方式上調(diào)TRAIL及其受體(DR4和DR5)的表達(dá),呈劑量依賴的下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá),上調(diào)BH3基因表達(dá),上調(diào)TAp63a基因表達(dá),p63RNA干擾抑制HUVECs TRAIL,DR4,和DR5的表達(dá)。 3. West-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)poly(I-C)上調(diào)HUVECs TLR3蛋白的表達(dá),在5-10μg/ml poly(I-C)干預(yù)的細(xì)胞時(shí)其TLR3蛋白表達(dá)水平較低,poly(I-C)下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),上調(diào)BH3蛋白表達(dá),上調(diào)TAp63a的表達(dá),TLR3shRNA下調(diào)TLR3并抑制HUVECs TAp63a的表達(dá),顯著抑制Bcl-2的下調(diào)和Noxa的上調(diào),P63RNA干擾下調(diào)HUVECs Bcl-2的表達(dá),上調(diào)Noxa的表達(dá),抑制HUVECs caspases8、9和PARP的激活。 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR數(shù)據(jù)顯示：poly(I-C)能顯著上調(diào)HUVECs的TLR3基因表達(dá)。 5. ELISA結(jié)果顯示poly(I-C)顯著上調(diào)HUVECs TRAIL表達(dá)。 結(jié)論：poly(I-C)可誘導(dǎo)HUVECs凋亡,TLR3通過上調(diào)TAP63a激活死亡受體及線粒體途徑誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡,損傷內(nèi)皮功能。
[Abstract]:The first chapter NOD2 expression in human aortic endothelial cells of type I interferon gene
Background: cell wall peptide two (MDP) is a kind of pathogen associated molecular patterns (PAMPs), MDP can be cytoplasmic nucleic acid binding domain -2 oligonucleotide (NOD2) identification of.NLRs is the innate immune molecules found in the animal body, first reported by stimulation of PAMPs by reacting function microbial molecular recognition NLRs is NOD1 (CARD4) and NOD2 (CARD15), NLRs can affect the process of atherosclerosis has been reported. Type I interferon family and human atherosclerotic plaque instability on.MDP can directly induce cytokines, including interferon production, activation and regulation of immune and inflammatory reaction. We found that MDP could induce HAECs expression of type I interferon. But the mechanism is not clear.
Objective: To observe the effect of MDP on the expression of HAECs class I interferon, and to explore the mechanism of MDP up regulating the expression of HAECs class I interferon gene through NOD2, and to discuss the effect of MDP on the expression of other inflammatory factors in HAECs.
Methods: according to the requirements of experiments using MDP HAECs, RT-PCR, qRT-PCR by HAECs IFN- alpha, IFN- beta, beta IL-1, IL-8 and MCP-1 gene expression induced by MDP and HAECs. The determination of type I interferon gene expression NOD1, associated with the technology of RT-PCR NOD2, TNF- alpha, IRFs expression, using Western-blot Technology to further study the mechanism of.
Result錛，

本文編號：1359100