發(fā)布時間：2017-12-29 12:31

  本文關(guān)鍵詞：VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs移植對腦梗死大鼠模型的治療作用及機(jī)制研究　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分 VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs對腦梗死大鼠模型治療作用的體外實驗 目的：觀察和檢測VEGF基因修飾后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在缺血環(huán)境下是否具有更強(qiáng)的分泌VEGF的能力,進(jìn)一步探討MSCs在缺血性再灌注腦損傷中的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供可靠依據(jù)。 方法：直接貼壁法分離培養(yǎng)MSCs,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pIRES2-EGFP-VEGFA真核表達(dá)載體導(dǎo)入MSCs,光密度值法及流式細(xì)胞術(shù)測其轉(zhuǎn)染率,Western Blot檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)VEGF基因的蛋白表達(dá)。線拴法制作SD大鼠左側(cè)短暫性大腦中動脈栓塞模型。尾靜脈注射法移植MSCs。ELISA法檢測大鼠腦組織以及MSCs培養(yǎng)體系中VEGF水平。 結(jié)果：pIRES2-EGFP-VEGFA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MSCs后48h在熒光顯微鏡下觀察,可見帶綠色熒光的細(xì)胞,光密度值法測其轉(zhuǎn)染率為(28±3.4)%,流式細(xì)胞術(shù)測其轉(zhuǎn)染率為(32±2.8)%。Western Blot檢測證實VEGF基因水平在轉(zhuǎn)染后的MSCs中較轉(zhuǎn)染前有更高表達(dá)。移植MSCs后腦缺血大鼠腦組織VEGF水平較未移植組明顯升高。體外實驗結(jié)果顯示,添加了缺血性腦組織提取液的MSCs培養(yǎng)體系中VEGF水平較未添加組明顯上升,VEGF基因修飾MSCs后其上升趨勢更為顯著。 結(jié)論：我們的實驗數(shù)據(jù)顯示,缺血環(huán)境可促進(jìn)MSCs分泌VEGF,經(jīng)VEGF基因修飾后MSCs分泌VEGF的能力得到進(jìn)一步加強(qiáng)。 第二部分 VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs對腦梗死大鼠模型的血管新生作用 目的：本部分實驗旨在大鼠MCAOI/R模型中證實VEGF基因修飾的MSCs移植對其具有血管新生作用,并對腦梗死后血管新生的機(jī)制進(jìn)行初步探索。 方法：SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,MSCs組和VEGF-MSCs組。線拴法制作tMCAO/R模型,MSCs組大鼠腦梗死后一天經(jīng)尾靜脈注射2×106個MSCs,VEGF-MSCs組大鼠腦梗死后一天經(jīng)尾靜脈注射2×106個轉(zhuǎn)染VEGF基因的MSCs。ELISA法測各組大鼠腦組織VEGF水平表達(dá)。免疫組化法觀察梗死區(qū)周邊Ang-2及CD34的表達(dá),Western-blot法測梗死區(qū)周邊Ang-2的蛋白表達(dá)。透射電鏡觀察腦梗死后大腦皮層血管間隙及水腫情況。 結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示,模型組大鼠梗死后腦組織VEGF表達(dá)水平升高并且在4d左右達(dá)到高峰,7-10d時回落至假手術(shù)組(正常)水平甚至更低；與模型組相比,VEGF-MSCs組和MSCs組在各個時間點VEGF水平都要明顯高于模型組(P0.05),且VEGF-MSCs組較MSCs組更高(P0.05),在第10d時仍維持較高水平。免疫組化的結(jié)果提示,梗死10d后VEGF-MSCs組和MSCs組梗死區(qū)周邊Ang-2陽性細(xì)胞數(shù)及CD34的表達(dá)均明顯多于模型組(P0.05),且VEGF-MSCs組較MSCs組更高(P0.05),Western-blot結(jié)果也顯示出同一趨勢。透射電鏡可以觀察到腦梗死后大腦皮層血管間隙明顯增寬,水腫明顯。 結(jié)論：VEGF基因轉(zhuǎn)染的MSCs移植tMCAO模型大鼠與移植MSCs組相比,更能提高腦梗死后梗死側(cè)腦組織VEGF的濃度,上調(diào)Ang-2水平,增加梗死區(qū)周邊微血管密度。我們推測VEGF與Ang-2的協(xié)同作用,可能是腦缺血后血管新生的機(jī)制之一。 第三部分 VEGF基因轉(zhuǎn)染MSCs對腦梗死大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用 目的：本實驗旨在通過觀察腦梗死后及MSCs,VEGF-MSCs移植tMCAO/R模型大鼠后一系列檢測指標(biāo)的變化,證實VEGF基因修飾的MSCs移植對tMCAO/R模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用,并對腦梗死后神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制進(jìn)行探討。 方法：SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,MSCs組和VEGF-MSCs組。NSS評分法對各組大鼠各個時間點進(jìn)行行為學(xué)評分。TTC法測各組大鼠的腦梗死體積。TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測腦梗死后各組大鼠梗死區(qū)邊緣神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量。透射電鏡觀察梗死側(cè)皮層神經(jīng)元細(xì)胞線粒體及突觸的變化。冰凍切片免疫熒光法觀察梗死側(cè)皮層神經(jīng)元的變化。免疫組化法觀察各組大鼠腦組織Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá),Western blot分析各組大鼠腦組織Caspase-3蛋白表達(dá)水平。實時熒光定量PCR技術(shù)對各組大鼠各個時間點Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。 結(jié)果：假手術(shù)組(正常)NSS評分為0,未見腦梗死,偶見生理性凋亡細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。VEGF-MSCs和MSCs組在4d,7d,10dNSS評分明顯低于模型組(P0.05),其中,VEGF-MSCs較MSCs組要更低(P0.05)。TTC結(jié)果顯示梗死10d后VEGF-MSCs組和MSCs組的腦梗死體積明顯低于模型組(P0.05),VEGF-MSCs組較MSCs組要更低(P0.05),TUNEL檢測結(jié)果也顯示出同樣的趨勢。透射電鏡結(jié)果顯示腦梗死后神經(jīng)元細(xì)胞線粒體腫脹變形,VEGF-MSCs組和MSCs組這種變化較輕,但兩組之間區(qū)別不大。腦組織梗死側(cè)大腦皮層冰凍切片免疫熒光可見腦梗死后神經(jīng)元細(xì)胞大量丟失,神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)系減少,VEGF-MSCs組和MSCs組這種改變也較輕。免疫組化及Western blot的結(jié)果都顯示,VEGF-MSCs組和MSCs組大鼠腦組織Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)及蛋白表達(dá)水平要明顯低于模型組(P0.05),其中VEGF-MSCs組較MSCs組更低(P0.05)。實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示腦梗死后Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高,VEGF-MSCs組和MSCs組與模型組相比升高得更明顯(P0.05),其中,VEGF-MSCs組較MSCs組要更高(P0.05)。 結(jié)論：VEGF基因修飾的MSCs移植tMCAO/R模型大鼠,可減少腦梗死體積,減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量,改善神經(jīng)功能。VEGF神經(jīng)保護(hù)作用其機(jī)制可能為VEGF促進(jìn)腦組織內(nèi)血管新生改善腦缺血區(qū)微環(huán)境以及移植后上調(diào)Bcl-2基因表達(dá),抑制Caspase-3有關(guān)。,
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 吳成翰;丁喜艷;王海燕;葉小包;黃繩躍;黃愛民;李會忠;吳松鷹;余吉;嚴(yán)曉華;;腦出血患者血腫周圍神經(jīng)元凋亡及相關(guān)調(diào)控基因的觀察[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2006年43期

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本文編號：1350337