本文關(guān)鍵詞：豬天然抗病毒分子APOBEC3F對(duì)豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的抑制作用研究　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：天然免疫(Innate immunity)是機(jī)體抵御病毒感染的重要機(jī)制,是機(jī)體抗感染的第一道防線,其在獲得性免疫(Adaptive immunity)活化前,發(fā)揮著抵御感染的重要作用。近年來(lái),一些介導(dǎo)天然免疫的新型宿主細(xì)胞因子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),如載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalytic polypeptide ,APOBEC)家族、三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(the tripartite motif protein family,TRIM)等。研究發(fā)現(xiàn)這類分子能夠通過直接或間接的方式抑制病毒的復(fù)制增殖,從而使宿主感染細(xì)胞內(nèi)的病毒含量下降。這些細(xì)胞內(nèi)因子的發(fā)現(xiàn)為研究新型抗病毒藥物提供了潛在的新靶標(biāo),目前已成為了研究的熱點(diǎn)。 APOBEC家族成員包括活化誘導(dǎo)的脫氨酶( activation-induced deaminase , AID)、APOBEC1、2及APOBEC3A~H,該類分子均具有胞嘧啶脫氨酶活性,其中抗病毒活性研究比較集中和透徹的是A3G(APOBEC3G)和A3F(APOBEC3F)。研究發(fā)現(xiàn)這類分子不僅可有效的阻止內(nèi)源性與外源性反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制,還可以抑制HBV等其它非反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制,它們主要是通過2個(gè)胞嘧啶脫氨酶活性區(qū)對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生的負(fù)鏈cDNA進(jìn)行脫氨基,導(dǎo)致C→U的高頻突變,造成病毒無(wú)法正常復(fù)制或?qū)е虏《救毕菟劳�。這類分子發(fā)揮抗病毒作用有賴于被包裝入病毒粒子,在感染下一個(gè)細(xì)胞時(shí)發(fā)揮其抗病毒效應(yīng)。由于APOBEC分子可直接抑制病毒復(fù)制,其抗病毒機(jī)制獨(dú)特而新穎,因此將其作為宿主自身抗病毒作用的調(diào)控靶標(biāo),已經(jīng)逐漸成為抗病毒感染的一條新途徑。 豬在異種器官移植研究上被寄予厚望,但其體內(nèi)存在內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Po- rcine endogenous retrovirus,PERV),而有證據(jù)表明PERV可以體外感染人源細(xì)胞;PERV的TM蛋白與HIV的TM蛋白相似,具有抑制免疫細(xì)胞活性的作用,這使豬源器官的生物安全性受到關(guān)注。研究人員嘗試了多種方法試圖去除供體豬體內(nèi)與器官內(nèi)的PERV,但都無(wú)法達(dá)到理想的效果。如果能以豬自身的免疫機(jī)制清除PERV或?qū)⑵湟种圃跇O低的滴度范圍內(nèi),那么PERV在異種器官移植上所能產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)就能得到有效的控制。豬體內(nèi)也存在一種APOBEC分子—pA3F(Porci- ne APOBEC3F,pA3F),相關(guān)研究表明pA3F能夠抑制MLV(Murine leukemia virus,MLV)及包括編碼Vif(Virion infectivity factor,Vif)蛋白在內(nèi)的HIV病毒復(fù)制,那么其對(duì)PERV是否也有相同的抑制作用呢?目前相關(guān)研究結(jié)果并無(wú)定論。2007年Jónsson SR.等通過長(zhǎng)期共培養(yǎng)PK-15細(xì)胞與293T細(xì)胞觀察豬的A3F蛋白對(duì)PERV感染293T細(xì)胞的抑制作用,其研究發(fā)現(xiàn)豬的pA3F無(wú)法抑制PERV對(duì)293T細(xì)胞的感染;但2011年D(?)rrschuck E.等通過PERV B感染性克隆與豬A3F相互作用發(fā)現(xiàn),豬的A3F蛋白能夠抑制PERV對(duì)293T細(xì)胞感染。為進(jìn)一步澄清pA3F是否具有抑制PERV復(fù)制的功能及其可能機(jī)制,我們通過對(duì)PK-15細(xì)胞中的PERV與pA3F的相互作用研究發(fā)現(xiàn): 1. pA3F具有抑制PERV的復(fù)制功能:我們?cè)赑K-15細(xì)胞中利用pA3F過表達(dá)及RNA干擾等手段,通過相對(duì)熒光定量PCR及ELISA方法對(duì)PERV pol基因mRNA及PERV反轉(zhuǎn)錄酶變化進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在pA3F過表達(dá)的PK-15細(xì)胞中PERV pol基因mRNA與PERV反轉(zhuǎn)錄酶水平與對(duì)照相比顯著降低(p0.05),在轉(zhuǎn)染30μg pA3F表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組改變最顯著,PERV pol基因mRNA變化倍數(shù)達(dá)到0.252±0.032,反轉(zhuǎn)錄酶降低至6.85±0.69pg/孔,且變化與pA3F的表達(dá)量之間具有劑量依賴關(guān)系;在pA3F下調(diào)細(xì)胞中PERV pol基因mRNA與PERV反轉(zhuǎn)錄酶水平與對(duì)照組比較顯著提高(p0.05),其中以沉默pA3F的740-764bp的序列最有效,pol基因mRNA增長(zhǎng)4.172±0.251倍,反轉(zhuǎn)錄酶達(dá)到88.58±1.46pg/孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,PK-15細(xì)胞中pA3F對(duì)PERV的復(fù)制具有抑制作用。 2. pA3F通過PERV gag蛋白的協(xié)助包裝進(jìn)病毒粒子發(fā)揮抗病毒作用:本研究通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)pA3F與PERV gag蛋白能夠形成復(fù)合物;激光共聚焦掃描顯微鏡細(xì)胞共定位觀察也證實(shí)兩種蛋白在PK-15細(xì)胞中存在共定位;pA3F基因轉(zhuǎn)染的PK- 15細(xì)胞培養(yǎng)上清收集的PERV病毒粒子,免疫印跡檢測(cè)證實(shí)病毒粒子中含有pA3F蛋白。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明pA3F是在PERV gag蛋白的協(xié)同下被包裝進(jìn)了PERV病毒粒子從而發(fā)揮其抑制PERV的作用。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)pA3F蛋白可以抑制PERV的復(fù)制,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明了其可能的作用機(jī)制,不但為利用豬自身的免疫防御清除或抑制PERV提供了新靶標(biāo),而且有可能對(duì)豬源異種器官移植的生物安全性找到了新的解決途徑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1350359