本文關(guān)鍵詞：IGFBP7基因在K562細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)及作用機制的探討　出處：《蘇州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分IGFBP7基因慢病毒載體的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞的表達(dá) 目的：構(gòu)建IGFBP7（insulin-like growth factor binding protein7）基因的慢病毒載體，為研究該基因在白血病中的功能提供基礎(chǔ)。 方法：采用限制性內(nèi)切酶酶切獲得目的基因，基因重組構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒venus-IGFBP7，用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒感染K562細(xì)胞，并采用多種方法鑒定。 結(jié)果：所獲IGFBP7基因經(jīng)測序與GenBank比對序列一致。慢病毒載體質(zhì)粒venus-IGFBP7經(jīng)BamH1酶切鑒定片段大小正確。熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測到GFP在293T及K562細(xì)胞中表達(dá)，RT-PCR和Western blot檢測到IGFBP7在K562細(xì)胞表達(dá)。 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建帶有IGFBP7基因的慢病毒載體，為研究IGFBP7基因在K562細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。 第二部分IGFBP7基因在K562細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究 目的：通過成功構(gòu)建IGFBP7-K562細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)株，觀察IGFBP7基因?qū)Π籽〖?xì)胞株K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、穿膜等生物學(xué)行為的影響，初步探討IGFBP7基因在AML中的生物學(xué)功能。 方法：通過CCK-8法及細(xì)胞集落實驗觀察IGFBP7對細(xì)胞增殖的影響。利用ELISA方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株培養(yǎng)上清中IGBP7的表達(dá)及觀察上述細(xì)胞培養(yǎng)上清對未轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞增殖的影響。通過流式分析細(xì)胞周期的變化及利用RT-PCR方法和Western Blot方法檢測cyclinD1的表達(dá)。通過穿膜實驗檢測IGFBP7基因?qū)562細(xì)胞穿膜能力的影響。 結(jié)果：通過cck-8檢測發(fā)現(xiàn)在第二天igfbp7轉(zhuǎn)染株相對于空載體載體轉(zhuǎn)染組明顯升高（升高23%），集落形成數(shù)量及大小igfbp7轉(zhuǎn)染組也明顯高于空載體組(39±4vs26±6,p0.05)。elisa檢測發(fā)現(xiàn)igfbp7轉(zhuǎn)染株組細(xì)胞培養(yǎng)上清中igfbp7表達(dá)水平明顯高于空載體組及陰性對照組（76.37±2.19μg/lvs63.52±2.29μg/land60.31±0.24μg/l,p=0.0001）,而且該培養(yǎng)上清具有促進(jìn)未轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞增殖的能力（igfbp7轉(zhuǎn)染株上清組vs空載體轉(zhuǎn)染株上清組：14%上升；d2;p0.05）。igfbp7轉(zhuǎn)染株組細(xì)胞周期g0/g1期比例下降至35.34%±3.36%，而s期升至56.08%±1.85%，相對空載體轉(zhuǎn)染組具有明顯意義（p0.05），同時cyclind1mrna水平及蛋白水平在igfbp7轉(zhuǎn)染組均是升高的。細(xì)胞穿膜實驗表明igfbp7轉(zhuǎn)染株組穿膜能力較對照組（空載體組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組）明顯升高(18080±630vs4250±653vs5388±855；p0.05)。結(jié)論：igfbp7基因具有促進(jìn)細(xì)胞的增殖、周期進(jìn)展及穿膜能力，從而產(chǎn)生癌基因樣作用。第三部分igfbp7基因在k562細(xì)胞中分子機制探討目的：為了進(jìn)一步明確igfbp7在k562細(xì)胞中引起的一系列生物學(xué)功能變化的具體分子機制，我們通過基因芯片及westernblot方法，從基因組與蛋白組水平來探索的該基因分子效應(yīng)作用機制。方法：通過基因芯片技術(shù)篩選出igfbp7轉(zhuǎn)染株與空載體轉(zhuǎn)染株差異表達(dá)基因，利用定量pcr及westernblot技術(shù)進(jìn)一步驗證。定量pcr法檢測igfbp7和akt3基因在40例初診急性髓細(xì)胞白血病的表達(dá)情況，通過相關(guān)性分析兩基因間的相關(guān)性。通過小分子抑制劑進(jìn)一步觀察細(xì)胞生物學(xué)特征的改變。結(jié)果：基因芯片篩選出10個差異表達(dá)基因進(jìn)行定量pcr驗證，，，其中包括akt3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芯片結(jié)果與定量pcr結(jié)果趨勢完全一致，證實了我們芯片結(jié)果的可靠性。同樣在igfbp7轉(zhuǎn)染株組中akt3總蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平亦升高。igfbp7和akt3基因在40例初診急性髓細(xì)胞白血病患者中表達(dá)量具有明顯相關(guān)性（r=0.505,p=0.001）。利用akt抑制劑（triciribine）作用轉(zhuǎn)染株后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展及穿膜能力均明顯受到抑制，而且akt3磷酸化水平也明顯下降，所以我們認(rèn)為igfbp7在k562細(xì)胞中通過活化akt信號通路引起了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及穿膜能力的變化。 結(jié)論：IGFBP7基因在AML中通過AKT信號通路引起了細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及穿膜能力的變化。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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